TLR4、7介导2型登革病毒感染小鼠APC的免疫应答及其信号转导通路

在较好前期研究工作基础上,利用DEN-2 NGC株感染小鼠树突状细胞（DC）2.4细胞,从mRNA和蛋白水平,检测感染后不同时间细胞内外TLR4、TLR7 、TNF-α、核内活性核因子κB、MyD88表达的变化;DC2.4细胞表面共刺激分子(B7-1、B7-2)和MHC Ⅱ类分子的表达百分率；培养上清IL-1、TNF-α、IFN-γ、IL-12的表达。设计针对MyD88的3对siRNA, 合成后转染DC2.4细胞,观察siRNA能否抑制siRNA转染小鼠DC2.4细胞MyD88的合成及其沉默效率，研究RNA干扰对DC 生物学活性的影响。MyD88 siRNA转染DC后给予 LPS刺激, 混合淋巴细胞培养检测T细胞增殖能力情况。并结合对DEN2感染后获得性免疫应答的特点进行综合分析，系统地探讨登革病毒感染的免疫机制，为登革病毒感染的发病机制的阐明提供坚实的理论依据。

利用细胞学 、蛋白组学、分子生物学和动物实验方法，通过对两株登革2型病毒（DENV-2）E蛋白N端158氨基酸基序与人源性DC 相互作用、DENV-2 NGC株吸附人血小板及相关免疫分子mRNA水平、两株DEN2株对鼠源性DC TLR4、TLR7表达影响及其信号通路相关蛋白表达与细胞因子分泌、对MyD88沉默的小鼠DC表达相关膜分子及炎症因子分泌的影响、体外诱导Ana-1极化和对其TLR7表达影响和MGB1对DEN2感染ANA-1细胞分泌TNF-α及NO的影响，为研究DEN2感染的发病机制提供科学依依据。.研究发现病毒蛋白免疫C57BL/6小鼠3周后腹腔注射DENV-2 NGC株，两组小鼠产生抗E蛋白特异性IgG类抗体动态水平有差异；PBMC来源的DC可以有效的与两种E蛋白结合；NGC-E作用48小时可使DC表面CD80,CD83,CD86,HLA-DR,CD11c表达增加，并使DC分泌大量IL-12；相同时间内B-E不能诱导DC成熟。人血小板蛋白免疫BALB/c小鼠可获得高效价的抗人血小板抗体；该抗体能部分阻断DENV-2吸附人血小板；IL-1β、COX-2 mRNA水平随病毒RNA水平的增加而升高，CD40L mRNA水平逐步降低。DEN2可感染小鼠髓源性不成熟DC；感染后TLR7蛋白的表达24h较正常对照组增高， MyD88、NF-κB蛋白的表达与病毒核酸水平呈正相关；随着病毒剂量增加， DC膜CD86、I-A/I-E的百分率呈上升趋势；随病毒mRNA水平增加TLR4、TLR7 mRNA水平降低。siRNA可有效阻断DEN2感染BMDC的胞内信号传导及其引起的成熟及炎症因子分泌；DEN2感染BMDC所致MyD88依赖途径活化，可产生大量的IFN-α。DEN2能够感染Ana-1细胞并诱导其向M1型极化，极化程度与病毒载量呈正相关； Ana-1细胞M1、M2型极化对TLR7表达无显著影响。重组HMGB1对DEN2在Ana-1胞内的复制、可抑制其分泌TNF-α,NO。.通过本项目培养硕士研究生7人；发表研究论文6篇，其中SCI1篇，核心杂志4篇；并对学科发展发挥了重要作用。