D39△1672缺陷菌株粘膜接种对肺炎链球菌感染的保护作用及机制研究

肺炎链球菌（S.pn）是一类很重要的致病菌，尤其对儿童具有更大的危害。疫苗是目前防止S.pn感染的一种重要手段，但目前使用的S.pn疫苗存在对儿童保护效果不佳、血清型覆盖率低等问题，有必要研发新的S.pn疫苗。本课题组自主筛选到一个与荚膜合成相关的体内诱导基因spd1672，通过替代失活方法敲出该基因构建了S.pn无荚膜缺陷菌株D39△1672，在小鼠机体中24小时内即被清除。在前期研究表明将其粘膜接种于成年鼠后，对多种肺炎链球菌株感染的保护率达到100%。因此是一个很有前景的S.pn减毒活菌疫苗。但其对婴幼鼠的保护作用、粘膜接种保护的作用机制、在体内被迅速清除的原因等还不十分清楚，因此本课题拟针对上述三个问题进行深入研究。本课题是首次针对短期定植的S.pn活菌疫苗进行的研究，可为获得安全、高效、质量可控的新S.pn减毒活菌疫苗提供可靠的实验依据，并为今后相关的活菌疫苗研发提供思路。

肺炎链球菌疫苗是控制其感染致病的有效手段，目前上市的基于荚膜多糖的疫苗都有较大缺陷，研制新型肺炎链球菌疫苗是该领域的重点和热点。本项目针对本课题组前期获得的一株减毒肺炎链球菌进行了活菌疫苗相关的研究，主要研究成果如下：.（1）首次证实位于cps基因簇上游调控序列的-10区的SNP T→C313713可导致细菌荚膜合成显著减少，这也是D39△CPS-TA毒力显著减弱的主要原因。该疫苗菌株不能使肺炎链球菌敏感小鼠C57BL/6J感染致病，其诱导小鼠肺部的炎症反应程度较轻，对小鼠肺上皮细胞（MLE-12）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的毒性反应较无毒株R6更弱，提示该疫苗安全性较高。.（2）保护效果及机制研究结果显示，C57BL/6J小鼠粘膜免疫该疫苗，能够抵抗不同血清型肺炎链球菌的定植和致死性感染，保护效率为80~100%，与市售疫苗相当，且乙醇灭活菌株后仍能获得较高的保护效率。免疫缺陷小鼠的研究显示，疫苗D39△CPS-TA可通过激活体液免疫反应和Th2、Th17和Treg型细胞免疫反应而发挥保护效应，其中体液免疫反应参与了对细菌定植和系统性感染的抵抗作用，Th17型细胞免疫反应则主要参与了对细菌定植的抵抗，而Th2型细胞免疫反应则主要参与了对系统性感染的抵抗，同时我们首次发现疫苗诱导的Treg型细胞免疫反应也参与了对细菌定植和系统性感染的抵抗作用。这些研究为疫苗的后期研发和其他新疫苗的研制提供了有价值的参考数据。.（3）首次对幼鼠的进行了肺炎链球菌活菌疫苗的保护作用研究，结果显示，疫苗粘膜免疫和皮下免疫，均能刺激幼鼠的体液免疫和Th1、Th17和Treg细胞免疫，产生高效价IgG抗体，有效对抗19F定植于鼻腔和D39的致死性感染，保护率为80~100%。粘膜免疫还能刺激幼鼠产生分泌型IgA和Th2型细胞免疫。.（4）为了能将疫苗D39△CPS-TA用于粘膜免疫，我们以DnaJ-△A146Ply融合蛋白为载体，首次观察了无溶血活性△A146Ply的粘膜佐剂效应。结果显示该蛋白粘膜免疫小鼠后，能显著提高DnaJ蛋白的IgG和IgA抗体效价，对肺炎链球菌的定植和侵袭性感染有显著的保护效应，提示△A146Ply是一种安全有效的粘膜佐剂。.通过本项目研究，培养了博士和硕士研究生各2名，已发表6篇CSCD论文，另有5篇SCI论文正在投、审稿阶段，并获得了1项中国发明专利。