PepO蛋白对肺炎链球菌感染的保护作用及机制研究

Surface proteins play key a role in the pathogenicity of Streptococcus pneumoniae (S.pn), and are being considered the most promising of the new third-generation vaccine component. Nowadays, available vaccines provide poor protective effects in infants, besides, this protection is always restricted to a certain number of serotypes of Streptococcus pneumoniae (S.pn). Results from our preliminary studies showed that both sortase A (SrtA) and Zinc metalloprotease B (ZmpB) can protect mice from pneumococcal infections, and could be used as candidate vaccines, but the protective efficiency can't still reach 80% , therefore, development of new S.pn vaccines is in urgent need. In this reserarch, we plan to study Endopeptidase O (PepO) as vaccine candidate, which is one of important virus factors, locating in S.pn surface. For this purpose, we will evaluate the protective efficiency of immunized intranally and intraperitoneally with this protein against a variety of pneumococcal infections in mice models. Moreover, we will evaluate the protective efficiency of the combined vaccine against a variety of pneumococcal infections, which includes PepO, SrtA, ZmpB in infant mice models. Then, with the help of vitro/vivo cell and mice models, we will apply fluorescence quantitative PCR, flow cytometer analyzer, indirect ELISA technology, et al, to explore in cell adhesion and invasion, induction of cytokines secretion by innate immune cells and induction of specific immune response, to clarify the molecular mechanisms of the protection. Through this study, we could reveal the protective efficiency of PepO and related molecular mechanisms, then, further base the rational design and study of new S.pn protein vaccines.

表面蛋白在肺炎链球菌（S.pn）致病过程中起关键作用，也是其最具潜力的新型第三代疫苗成分。目前已有的S.pn疫苗存在对儿童保护效果不佳，血清型覆盖率低等问题，本课题组前期研究显示，转肽酶A（SrtA）和锌金属蛋白酶B（ZmpB）对多种血清型S.pn的感染都有保护作用，但保护效率仍不能达到80%，因此，有必要研发新的S.pn疫苗。本研究拟选用S.pn表面毒力因子内肽酶O（PepO）为研究对象，经粘膜及腹腔两种途径免疫小鼠，构建多种S.pn感染模型，在评价其作为疫苗候选蛋白潜力的基础上，将PepO与SrtA, ZmpB蛋白联合免疫婴幼鼠，评价联合疫苗的保护效果。同时，借助体内外模型，采用荧光定量PCR，流式细胞术，ELISA等技术，探索其在细胞粘附、侵袭及诱导天然免疫细胞分泌细胞因子和诱发特异性免疫应答等方面的效应，为该疫苗的进一步研究提供理论依据，并为合理设计和研发S.pn蛋白疫苗提供新思路

肺炎链球菌（S.pn）定植人体可引起严重的感染性疾病，包括菌血症、肺炎、脑膜炎等，甚至可致死亡。随着抗生素耐药不断加剧，疫苗成为控制S.pn感染的有效手段。PepO作为一种金属内肽酶，参与机体免疫过程的生理、病理调节，是S.pn重要的毒力因子，也是最具有潜力的新型第三代疫苗候选因子。.本项目针对该PepO蛋白疫苗展开相关研究，主要成果如下：①采用体外分子克隆技术获得纯化PepO蛋白，免疫小鼠制备高效价的PepO蛋白特异性抗血清，并在多种血清型S.pn菌株中验证蛋白的保守性。②全面评价PepO蛋白作为疫苗候选因子的保护作用，经皮免疫结果显示：PepO蛋白经皮注射C57小鼠可降低S.pn在宿主鼻咽部和肺部感染的细菌量，对S.pn致死性感染有一定保护作用，但保护率未达到50%，PepO与ΔPly进行联合免疫并不能增强保护效果，但PepO特异性抗血清对S.pn感染有显著的保护作用，高达80%。③经鼻腔黏膜免疫结果显示：PepO蛋白经黏膜免疫BALB/c小鼠可刺激宿主产生高效价的IgA及IgG抗体，抗体亚型以IgG1为主，对S.pn的定植和致死性感染均能提供保护作用，保护率可达40-60%。PepO和PsaA蛋白联合免疫，保护作用具有叠加效应，保护率提高至为60-80%，且显示出更好的抗定植效果。④分子机制研究结果显示，PepO及其特异性抗血清均能抑制S.pn与A549细胞粘附，提示PepO参与S.pn的黏附与定植，与PsaA联合具有协同作用。细胞因子检测结果提示，PepO免疫小鼠后，体液免疫和细胞免疫均参与免疫保护作用，Th1，Th2，Th17和Treg型免疫反应均被激活，其中Th1和Treg型免疫反应参与对细菌定植和系统性感染的抵抗作用，Th17型免疫反应主要参与了对细菌定植的抵抗，Th2型免疫反应则主要参与了对系统性感染的抵抗。.综上结果提示，PepO蛋白可以作为S.pn疫苗的候选蛋白，PepO/PsaA联合蛋白疫苗是一组有开发潜力的蛋白疫苗组合，黏膜免疫是一种有效的免疫途径，这为研究新型抗菌药物作用靶点及蛋白联合疫苗提供理论依据。通过本项目研究，培养了博士和硕士研究生各1名，已有3篇CSCD论文发表，1篇CSCD论文发表接收，1篇Medline论文、2篇SCI论文正在投、审稿阶段。