敬钊缨毛蜘蛛素-V以海马Kv4.2消退为调控基点的促进LTP诱导和认知障碍改善作用的分子机制研究

JZ-V is a novel peptide neurotoxin isolated from the venom of spider Chilobrachys jingzhao. All research results involved in this proposal are completely new findings both national and international,the patent (201110369614.3.) we applied is in processing: We found that JZ-V significantly enhanced LTP induction in the electrophysiology research and improved cognition impairment in the study of behaviour. The goal of this study is to investigate the mechanisam of its pharmacological action. Due to the inhibiting effect of JZ-V on Kv4.2 encoded potassium channel expressed in Xenopus oocytes, and the affinitive relationship of hippocampus Kv4.2 with synaptic plasticity and learning and memory, this project will focus on Kv4.2 "subsiding" and detect the internalization, the phospholation and change of A-type potassium currents induced by various regulating factors using Kv4.2-knock out mice , slice, rat and neuron from newborn rat, to explore the new target of JZ-V. JZ-V is available for synthesizing in large scale , the investigation about its mechanism will promote new drug development for AD and cognition impairment disease, and advantage unusual natural resources exploring and Chinese intellectual property protecting

JZ-V是从我国新发现的敬钊缨毛蛛中分离纯化到的一种新型短肽类物质。本课题相关发现均为国内外首创，已申请国家发明专利:201110369614.3。前期研究发现：1.电生理学研究显示 JZ-V可显著加强学习记忆分子模型-LTP的诱导。2.行为学研究显示JZ-V对不同痴呆动物模型认知障碍具有显著改善作用。本课题将在原有基础上深入探讨JZ-V促进LTP诱导，改善认知障碍的分子机制，基于已发现的JZ-V对非洲爪蟾卵母细胞Kv4.2通道电流的抑制作用及海马Kv4.2与突触可塑性和学习记忆的密切关系，本课题将以各种形式的海马Kv4.2的消退为中心点，围绕各种因素引起的内化、磷酸化和通道电流变化等，采用基因敲除小鼠、急性脑片、在体大鼠，新生鼠海马细胞等多层次样本，探寻JZ-V分子作用靶点。JZ-V已可全合成，可大规模生产，此研究将利于痴呆等认知障碍类疾病的药物发现，开发我国稀有生物资源，保护知识产权

本项目采用多种技术手段和多层次研究样本，综合研究了敬钊缨毛蛛蜘蛛素-V（JZ-V）对东莨菪碱和Aβ不同病理机制痴呆模型学习记忆障碍的改善作用及分子机制，以KV4.2为基点，涵括了突触传递，胆碱能系统，突触可塑性蛋白，离子通道以及能量代谢不同层次的探讨。电生理研究发现JZ-V显著增强EPSP，增强LTP诱导，且在体作用大大强于离体脑片，说明JZ-V体内代谢物发挥更大作用，值得深入研究。我们测定了JZ-V对痴呆动物认知能力的影响，发现学习记忆障碍相关指标均得以显著改善，行为学数据与LTP结果相吻合，这为由于没有直接证据而存有争议的LTP与学习记忆的关系提供了直接的实验依据。研究发现JZ-V抑制CA1 锥体神经元全细胞A型钾电流，IA下调，激活及失活曲线向去极化方向漂移，改变了A型钾通道的动力学特征。IA调节突触的输入和动作电位的反向传播，从而在信号整合及突触可塑性，LTP等过程中扮演重要角色。所以，JZ-V对于CA1 锥体神经元全细胞A型钾电流的作用可能为其对LTP作用的重要机制之一。.Kv4.2为IA的主要成分，JZ-V对于IA下调意味着Kv4.2的“消退”，这种消退可能与其“内化迁移”相关联，所以我们研究了JZ-V 对Kv4.2 及相互作用蛋白KChIP2 表达及“内化迁移”的影响。以Na/K-ATPase和 EEA1分别作为标志蛋白分离细胞膜和内涵体，研究发现 JZ-V 对Kv4.2和KChIP2在细胞膜和内涵体的蛋白表达与对照组相比无明显差别，意味着JZ-V没有导致Kv4.2和 KChIP2“内化迁移”。但研究发现JZ-V显著增强了KChIP2的表达，KChIP2参与调节IA电流，和Kv4.2相互作用，所以JZ-V 对于KChIP2表达的作用可能为Kv4.2影响对于CA1 锥体神经元IA的主要机制之一。.本项目还研究了JZ-V对于与学习记忆关系较为密切的额叶、颞叶以及海马组织中葡萄糖的摄取率，发现JZ-V对葡萄糖代谢水平无显著作用，提示蜘蛛素在对于脑能量代谢并无影响。研究还发现：JZ-V作用于胆碱能系统的ChAT和AChE活性，以及突触可塑性蛋白，显著提高蛋白Synapsin与GAP-43的表达。.综上所述，本项目的创新性在于上述研究数据皆为首次发现，本项目的实用价值在于JZ-V已可全合成，可大规模生产，保障临床需要。