我国食品中空肠弯曲菌耐药状况及分子流行变异规律研究

本课题以严重影响人民健康的重要食源性致病菌空肠弯曲菌为研究对象，以国家食品污染物监测网从不同食物样本分离的菌株为基础，结合临床分离菌株，参照国际标准菌株，运用生物分型、耐药谱测定、16S-23S rDNA 及其间区序列分析及PFGE、FAFLP、PCR-RFLP等分子分型技术，全面系统地研究我国食物样本中空肠弯曲菌的生态分布、耐药状况、耐药分子特征以及分子流行变异规律。研究成果，可获得我国和国际上食品中空肠弯曲菌和人源性菌株耐药谱及基因多态性的比较分析资料，阐明我国不同年代、不同地域、不同样本分离菌株及其耐药性的分子流行变异特点及其与GenBank中相关菌种的系统发育关系，全面掌握分离株的生物学特征和指纹图谱特征，为建立该菌的分子分型和溯源数据库，提供科学依据和实验数据。也可为科学预防、治疗和溯源耐药菌株引起的食源性疾病的暴发提供理论和技术支持，并填补该领域的研究空白。

空肠弯曲菌是一种重要的食源性人兽共患病病原菌，随着感染率不断上升，引起国际社会广泛关注。本研究通过采集全国食源性疾病监测网食物样本，分离空肠弯曲菌，并对其进行系统的生化和分子生物学鉴定及耐药分析及分子分型，研究其基因多态性及遗传变异规律，建立空肠弯曲菌溯源分析数据库。. 采用国标传统方法对81株疑似空肠弯曲菌分离株进行鉴定，多重PCR进行验证。结果表明多重PCR鉴定与传统方法鉴定结果符合率为100%；而商品化鉴定系统与传统方法鉴定结果符合率为85.2%。选用八类共计14组抗生素，采用琼脂稀释法对确证的72株空肠弯曲菌分离株进行药物敏感性测定和耐药谱分析。结果显示：耐药率居前三位的抗生素依序为喹诺酮类、四环素类和头孢菌素类；对青霉素类中的阿莫西林/克拉维酸及磺胺类药物显示为中等耐药；对大环内酯类、氨基糖苷类、林可酰胺类和美罗培南显示为低度耐药；对氯霉素显示为全敏感。72株分离株共产生31种耐药谱型，且多重耐药严重。. 设计特异性引物，扩增空肠弯曲菌16SrDNA-23SrDNA及间区序列并测序。利用BioNumerics软件比对分离株及GeneBank中的相关菌株序列，绘制系统进化发育树。结果显示，人源和动物源分离株序列相似度极高，在分子生物学上存在高度同源性；我国食品中空肠弯曲菌分离株均被鉴定为空肠弯曲菌空肠亚种，在进化过程中较为保守，未见异常分支。 选用SmaⅠ和KpnⅠ限制性内切酶进行单酶切，采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对72株空肠弯曲菌分离株进行分子分型。共产生48种带型，按照63.9%相似度，可将72株分离株分为A~M共13个群，不同省份来源的分离株在各群中散在分布，而同一带型的菌株显示具有完全地域同源性。对72株分离株进行荧光标记扩增片段长度多态性分析（FAFLP），共产生241条多态性片段、 72种带型，分为11个群，群内最高相似度为94.9%。A群分为5个亚群。B群为优势群，包含54株菌，分为15个亚群，多个亚群菌株显示有完全地域同源性。扩增72株分离株16SrDNA、23 SrDNA及其间区序列DNA片段，选用AluⅠ和MnlⅠ进行酶切，获得图谱进行聚类分析。结果表明各分子分型结果及进化关系存在明显相关性。. 该数据库的建立，可为空肠弯曲菌引起食源性疾病的诊断、监测、溯源和暴发流行预警及治疗抗生素的选择提供科学依据。