p27基因缺失通过激活Shh信号通路发挥促进成骨细胞骨形成的作用及机制研究

To determine whether p27 could act as a transcriptional co-repressor with p130/E2F4 complex at the Shh promoter and result in repression of Shh, which can inhibit the proliferation and differentiation of BM-MSCs and osteoblastic bone formation. Firstly, we confirmed the up-regulation or down-regulation at mRNA and protein levels from microarray analyses which have performed in long bone extracts from p27-/- mice and their wild-type littermates. Secondly, we detected whether p27 could repress Shh transcription by directing interaction with p130/E2F4 via bioinformatics and molecular biology method. Finally, we treated WT and p27-/- mice with Shh antagonist Vismodegib or Shh knockdown plasmids, and compared the bone phenotype of different group mice to clarify whether repression of Shh could inhibit stimulating osteoblastic bone formation for p27 loss in vivo. Our results could explore a novel mechanism about p27 repressing Shh transcription independently of CDK regulation and provide understanding of Shh signalling in bone development, homeostasis and diseases and also provide new targets of bone disease prevention, diagnoses and therapeutics.

为了研究p27能否作为转录共抑制子与p130/E2F4共同作用，发挥转录抑制Shh的功能，抑制骨髓间充质干细胞增殖和分化，影响成骨细胞骨形成。首先，我们利用细胞分子生物学方法验证已获得的基因芯片结果，明确p27基因缺失骨组织中Shh信号通路是否被激活，进而促进了BM-MSC增殖和向成骨细胞分化；继而，我们利用生物信息学和细胞分子生物学方法，检测p27基因是否与p130/E2F4复合物共同作用于Shh基因启动子区域发挥转录抑制功能；最后，我们使用Shh信号通路特异性抑制剂Vismodegib灌胃或尾静脉注射Shh敲低质粒处理WT和p27-/-小鼠，比较分析它们与对照组小鼠表型差异，观察抑制Shh表达是否能够在体抑制p27基因缺失引起的骨形成增加。本研究有望阐明p27通过CDK非依赖性方式调控Shh信号通路的新机制，加深对Shh信号在骨稳态和疾病中作用机制的理解，为骨骼疾病的防治提供新的靶点。

本研究为了明确p27基因缺失促进骨形成的机制，利用全基因组表达谱基因芯片分析了同窝2周龄WT与p27-/-小鼠长骨骨组织基因表达谱的差异。结果发现p27-/-小鼠骨组织中Shh信号通路分子激活。利用实时荧光RT-PCR和Western-blot方法验证了芯片结果。这些结果提示p27缺失引起的成骨细胞骨形成增加可能与Shh信号通路激活有关。接着我们使用Shh信号通路抑制剂KAAD-Cyclopamine分别处理WT和p27-/-小鼠来源的BM-MSCs，对形成的成纤维细胞集落进行甲基蓝染色和ALP细胞化学染色，通过图像分析CFU-f 和ALP 阳性CFU-f 面积的变化。结果显示p27基因缺失能够通过激活Shh信号通路，促进骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化。在体实验进一步证明了骨容量、成骨细胞数、碱性磷酸酶和I型胶原阳性面积在给药组均明显较对照组显著降低，在p27-/-小鼠给药组降低更为明显。这些结果说明p27缺失能够通过激活Shh信号通路，促进成骨细胞骨形成。染色质免疫共沉淀（ChIP）、凝胶电泳迁移实验（EMSA）、双报告基因活性检测等结果说明p27能够与E2F4协同作用抑制Shh的表达。为了明确Bmi1基因敲除在阻断p27缺失激活的Shh信号通路中的作用，我们建立了Bmi1和p27双基因敲除（Bmi1-/-p27-/-）小鼠模型，比较分析它们与同窝单基因敲除及WT小鼠的骨骼表型差异。结果发现：与p27-/-小鼠相比，Bmi1-/-p27-/-小鼠生存期显著缩短，体重、骨量、成骨细胞数、碱性磷酸酶和I型胶原阳性面积及成骨细胞相关基因均明显降低，这些参数与Bmi1-/-小鼠无明显差异。细胞学实验进一步证明Bmi1是p27缺失激活的Shh信号通路的主效基因。本研究结果证明了Bmi1是p27基因缺失引起Shh信号通路激活的关键效应分子。这些结果说明不仅通过上调Bmi1能够防治骨质疏松，而且通过抑制Bmi1能够防治Shh信号通路激活引发的肿瘤。