Bmi1淋巴细胞过表达通过改善造骨微环境发挥促进骨形成作用的机制研究

To investigate whether the overexpression of Bmi1 in lymphocytes can stimulate osteoblastic bone formation by improving the osteogenic microenvironment, we will generate Bmi1 gene knockout mice with Bmi1 overexpression in lymphocytes (EµBmi1/Bmi1-/-) for comparison with the EµBmi1 transgenic, Bmi1-/- and wild-type littermates using pathohistological, cellular and molecular techniques to observe whether the overexpression of Bmi1 in lymphocytes can rescue osteoporosis caused by Bmi1 deficiency. Furthermore, the serum and the conditioned medium will be harvested from wild-type, EµBmi1 transgenic, Bmi1-/- and EµBmi1/Bmi1-/- mice and cultures of lymphocytes derived from wild-type and EµBmi1 transgenic mice, respectively, and will be analyzed using serum protein array or proteomics approaches. The potential factors for the osteogenic microenvironment will be screened. Bone marrow mesenchymal stem cell (BM-MSCs) will be cultured with the screened factors or the conditioned medium from cultures of lymphocytes derived from wild-type and EµBmi1 transgenic mice in absence or presence of neutralized antibodies against the screened factors, the proliferation, differentiation and calcification will be examined by cellular and molecular methods to identify whether the potential factors for the osteogenic microenvironment play roles in stimulating the proliferation of BM-MSCs and differentiation into osteoblasts. The results of this study will provide an experimental and theoretical basis for a new strategy for prevention and treatment of osteoporosis by improving the osteogenesis microenvironment.

为了研究淋巴细胞Bmi1过表达通过改善造骨微环境发挥促进骨形成的作用机制，我们将建立淋巴细胞Bmi1过表达的Bmi1-/-(EµBmi1/Bmi1-/-)小鼠模型，采用组织病理学、细胞及分子生物学方法比较分析其与EµBmi1小鼠、Bmi1-/-小鼠及野生型小鼠之间的表型差异，观察淋巴细胞Bmi1过表达能否矫正Bmi1缺失引起的骨质疏松；进而我们将收集上述小鼠血清，或野生型和EµBmi1小鼠来源的淋巴细胞培养上清，利用血清蛋白芯片或蛋白组学的方法，应用生物信息学方法筛选潜在的造骨微环境因子；将筛选到的潜在造骨微环境因子，或上述细胞培养上清含或不含这些因子的中和抗体处理培养的野生型或Bmi1-/-小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)，利用细胞分子生物学方法分析细胞增殖、分化和钙化的变化，鉴定这些因子在促进BMMSC增殖和向成骨细胞分化中的作用，为通过改善造骨微环境防治骨质疏松提供理论和实验依据。

为了研究Bmi1在淋巴细胞中的过表达是否可以通过改善成骨细胞的微环境来促进骨形成，我们分析了淋巴细胞中过表达Bmi1的EμBmi1转基因小鼠的骨骼表型。与野生型（WT）小鼠相比，EμBmi1小鼠的骨骼大小，骨小梁体积和成骨细胞数量，骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）的增殖和分化指数均显著增加，组织ROS水平降低，抗氧化能力增强。在PTHrP1-84敲入（KI）小鼠中，Bmi1的表达水平降低并可能介导其骨质疏松症。因此，我们构建了淋巴细胞中过表达Bmi1的KI（EμKI）小鼠，并将其与同窝KI和WT小鼠进行比较。Bmi1淋巴细胞过表达明显延长了KI小鼠的寿命，增加了体重并且改善了其骨骼生长和成骨细胞骨形成，ROS水平和DNA损伤应答相关指标降低。我们还通过构建EμBmi1卵巢切除（OVX）的骨质疏松小鼠模型，并将其与假手术组和WT-OVX组进行比较，观察Bmi1淋巴细胞过表达对OVX小鼠骨骼表型和骨组织氧化应激水平的影响。Bmi1淋巴细胞中的过表达可以通过抑制氧化应激的蓄积和CD4阳性T细胞的活化来改善卵巢切除术所诱导的破骨细胞发生和骨丢失。最后我们通过蛋白芯片分析，比较了WT与EμBmi1转基因小鼠血清中蛋白分子表达水平的差异，发现EμBmi1转基因小鼠血清中白介素15（IL-15），胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP7）等五种蛋白的表达水平与WT小鼠相比出现了明显的升高。体外加入重组小鼠IL-15蛋白能够明显增强BM-MSCs的成骨向分化和矿化的能力，同时也能促进RAW264.7细胞向破骨细胞的分化。本研究结果利用Pthrp KI小鼠和OVX小鼠模型证明Bmi1淋巴细胞过表达能够通过释放微环境相关因子改善造骨微环境，促进BM-MSCs 增殖和向成骨细胞分化，发挥促进骨形成抗骨质疏松的作用。这一研究成果为通过改善造骨微环境防治骨质疏松新策略提供了理论和实验依据。