小麦条锈菌三个毒性突变体致病相关基因克隆与功能研究

小麦条锈菌通过毒性变异产生新的毒性小种是导致小麦品种抗病基因失效的主要原因，而揭示小麦条锈菌的毒性基因及其变异机制，对解决品种抗病性丧失问题有着十分重要的理论和实践意义。本项目拟利用基因枪法导入含有GUS标记的质粒到小麦条锈菌获得的3个小麦条锈菌毒性突变体为研究对象，通过TAIL-PCR技术从突变菌系中扩增获得插入位点侧翼序列，搜索GenBank及本实验室建立的小麦条锈菌EST序列数据库，利用生物信息学获得致病相关基因的cDNA序列，并利用RACE技术获得基因全长cDNA；借助其他病原菌体系分析致病相关基因的功能；利用PVX系统转化烟草及真核表达产物微注射小麦，进行致病相关基因在病菌与寄主互作中的功能分析。研究结果将有助于剖析我国小麦条锈菌毒性变异特点，为条锈菌变异机制的揭示奠定基础，进而为小麦条锈病的防治提供理论依据。

本项目通过特异引物PCR扩增以及x-Gluc方法开展了小麦条锈菌pGUS质粒插入突变菌株Y-26-7，K-2-7，Z-2-7中GUS基因稳定性检测，并用20个小麦抗条锈病国际近等基因系和37个小麦主栽品种进行突变菌株毒性谱的测定。结果表明，K-2-7菌株中扩增出的GUS条带最明显，Y-26-7次之，Z-2-7亮度最低；x-Gluc染色结果表明，K-2-7菌株夏孢子堆中GUS基因稳定表达，而Z-2-7的夏孢子堆中，GUS基因表达的夏孢子被稀释。毒性谱测定结果表明，K-2-7菌株发生毒性突变，Y-26-7发生毒性分离，而Z-2-7发生非毒性突变。表明突变菌株中外源GUS基因的稳定表达使菌株发生毒性突变。.利用Tail-PCR扩增了GUS基因插入片段的侧翼序列，经过3轮PCR扩增后对条带进行回收，连接和转化，获得了6个序列，其中一个序列经过Blast同源性分析确定为磷酸甘露糖变位酶基因。对该基因及其表达产物进行了ORF分析、信号肽预测、跨膜区预测、亚细胞定位、AA糖基化残基预测、AA磷酸化位点预测以及功能结构域分析；构建了磷酸甘露糖变位酶基因的进化树，对相关真菌的磷酸变位酶基因同源性进行了分析，预测了蛋白的二级结构和三级结构。以β-actin为内参基因，利用实时定量PCR方法确定该基因在小麦条锈菌夏孢子萌发、生长、侵染、扩展和孢子形成过程中表达量的变化，该基因在接种6h开始表达，24h表达量最高，说明该基因在小麦条锈菌-小麦互作早期就有表达，在小麦条锈菌的侵染过程中起重要作用。.开展了小麦品种天选43及M852-1抗条锈病基因的SSR标记研究，将抗条锈基因YrTianxuan43定位在小麦1BS染色体近着丝粒区域，将YrElm定位于小麦染色体3DS上。开展了陕西省115个小麦品种（系）抗条锈病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr18和Yr26的分子检测，确定了小麦品种对当前条锈菌流行小种和新毒性小种V26的抗病性，建议今后的小麦育种中加强Yr5和Yr18等抗病基因的聚合和利用。