受条锈菌诱导的小麦类受体激酶基因的克隆及功能分析

条锈病是我国小麦生产上的重要病害。由于条锈菌不能人工培养，尚未发现其有性时代，并且小麦基因组庞大和复杂的原因，因而没有有效方法在分子水平上对小麦抗条锈病机理进行系统的研究。前期，从小麦与条锈菌互作差异表达序列中筛选到三个小麦TaRLK、TaLRR-RLK、TaSTK基因。实时荧光定量PCR分析表明，它们在小麦抗条锈中具有一定的作用。本项目拟通过电子克隆和RACE技术获得基因全长；qRT-PCR技术分析三个基因在小麦与条锈菌互作、非生物胁迫中的表达特征，及可能参与的信号通路；通过亚细胞定位，明确蛋白在细胞的分布特点及蛋白质各结构域的功能；利用酵母系统表达激酶GST 融合蛋白，进行激酶自我磷酸化活性分析，明确近膜区对类受体激酶磷酸化活性的影响。利用建立的病毒诱导的基因沉默技术分析TaRLK、TaLRR-RLK、TaSTK基因在小麦与条锈菌互作中的功能，为解析小麦对条锈菌的抗性机理奠定基础。

小麦条锈病是我国小麦生产上危害最严重的病害之一。病菌频繁变异导致品种抗性丧失，常引发病害的暴发流行，因而寻求持久防治病害策略成为亟待解决的重大问题。为此，本项目从在植物先天免疫中起重要作用的蛋白激酶入手，分离重要蛋白激酶，并开展蛋白激酶抗病作用机理的研究，对揭示小麦抗条锈病机理具有重要意义，进而为通过新策略利用植物抗病性持久防治病害提供重要的理论依据。本项目通过筛选cDNA文库获得了3个小麦蛋白激酶基因，TaLRR-RLK、TaBRI1和TaSTK。TaLRR-RLK和TaBRI1编码蛋白定位于细胞质膜，结构上具有N端信号肽、富含LRR的胞外域、跨膜结构域和胞内域，而TaSTK编码蛋白定位于细胞质；qRT-PCR表达分析发现，三个蛋白激酶在伤害、低温、干旱以及激素处理下，呈现多样化的表达水平和模式。TaLRR-RLK和TaBRI1在小麦与条锈菌抗病互作过程的早期不同程度的上调表达，而在亲和反应中表达量无明显变化，表明它们可能以不同的方式参与了小麦抗条锈反应； BSMV-VIGS瞬时沉默TaLRR-RLK、TaBRI1和TaSTK后，接种无毒小种CYR23，发现在TaLRR-RLK和TaBRI1沉默植株上坏死点附近产生少量夏孢子堆，而TaSTK沉默植株表型与对照无明显变化。组织学观察显示，在TaLRR-RLK和TaBRI1沉默植株中，菌丝长度较对照明显增长，单个侵染点附近菌落面积增加，而每个侵染点H2O2 积累面积和过敏性坏死面积比对照明显减少。同时，防卫相关基因表达量在沉默植株中被不同程度抑制，而清除活性氧相关基因被急剧大量诱导上调表达。上述结果表明TaLRR-RLK和TaBRI1的沉默减弱了小麦对条锈菌CYR23的抗性，它们在小麦对条锈菌侵染防御过程中起正向调控作用；通过酵母双杂交系统筛选获得TaLRR-RLK的两个候选互作蛋白，N11编码一个核酮糖二磷酸羧化酶/氧合酶小亚基，N47编码一个受胁迫诱导的短肽；另外，通过基因枪转化小麦获得了TaBRI1的T3代转基因植株。上述研究为合理利用小麦抗病性开展小麦抗条锈病的遗传改良，进而持久控制条锈病提供重要的理论依据和物质基础。. 在本项目执行过程中，先后在Journal of Experimental Botany、Molecular Plant Pathology等SCI刊物上发表论文3篇。