microRNA let-7f抑制胃癌转移的分子机制研究

Metastasis is a major clinical obstacle in the treatment of gastric cancer (GC) and accounts for the majority of cancer-related mortality. MicroRNAs have been recently emerged as important regulators of metastasis through acting on multiple targeting genes and signaling pathways. We have previously identified a set of miRNAs that diffential expressed between two pairs of high and low metastaic GC cells using microarray in the study of transcriptional factor SRF in GC metastasis. Among these miRNAs, let-7f showed the most potent effect on inhibiting GC cell invasion and metastsis. In the present study, we further investigated the underlying mechanism of let-7f in GC invasion and metastasis. A high-throughput method that combined bioinformatics and proteomics will be used to predict and screen the potential targeting genes of let-7f. High-throughput functional assays will be employed to test the roles of the candidates of let-7f. At last, expression of these related effectors and let-7f itself will be testified in human GC tissues. The relation between let-7f, along with its effectors, and GC prognosis will be discussed. This program will provide an insight into the specific biological behavior of let-7f in GC metastasis and would be helpful in the therapeutic application to block GC metastasis.

胃癌转移是导致治疗失败和患者死亡的主要原因，其确切机制仍不清楚。microRNA可通过作用于多基因、多信号途径在转录后水平发挥重要的调控作用，但其在胃癌转移中的机制尚未阐明。我们前期在胃癌转移细胞株GC9811-P中敲除有促转移作用的转录因子SRF后，发现多个miRNA差异表达。进一步对表达上调显著的miRNA进行表达验证和功能研究，发现其中let-7f在胃癌转移灶中低表达且能显著抑制胃癌转移。本项目拟采用生物信息学结合分子生物学方法，高通量筛选let-7f的靶基因，运用高内涵系统批量研究靶基因功能，并利用免疫共沉淀、表面等离子体共振和干预实验等深入研究let-7f靶基因相互作用及其在转移相关信号通路中发挥的作用，以寻找出有实质性网络调控作用的关键效应分子。本项目旨在揭示let-7f通过调控多基因、多信号途径抑制胃癌转移的分子机制，为胃癌转移早期预警和靶向干预提供理论和实验依据。

胃癌的死亡率一直居高不下，其中胃癌转移是导致胃癌患者死亡和治疗失败的主要原因，而转移的分子机制尚不清楚。本实验通过研究对两株转移能力不同的胃癌转移细胞系进行microRNA芯片分析，发现多个可抑制胃癌转移的miRNA，其中以let-7f 抑制胃癌转移作用最为显著。主要研究内容：1.通过qRT-PCR的方法检验let-7f-5p在胃癌细胞中的表达，转染let-7f-5p的类似物及抑制物通过transwe11实验检验let-7f-5p对胃癌转移的影响；2.通过生物信息学预测的方法预测let-7f-5p的靶基因，并运用qRT-PCR、双荧光素酶报告基因实验及Westernblot实验验证let-7f-5p与其靶基因的调控关系；3、通过免疫组化和实时荧光定量PCR实验验证let-7f-5p靶基因在胃癌及癌旁组织之间的表达。结果:一，在胃癌高低转移细胞系MKN28M、MKN28NM中验证了let-7f-5p在胃癌高转移细胞系中低表达，在胃癌低转移细胞系中高表达；在高转移细胞系MKN28M中转染let-7f-5p的类似物使其上调，在低转移细胞系MKN28NM细胞系中转染let-7t-5p的抑制物使let-7F5p下调，通过tanswell迁移和侵袭实验发现let-7f-5p与胃癌细胞的迁移能力和侵袭能力呈负相关关系。二，通过生物信息学预测的方法发现FNDC3B 与人MMP11的3’-UTR上有与let-7f-5p结合位点，通过双荧光素酶报告基因实验和Westernblot验证了let-7f-5p通过与FNDC3BmRNA的3’-UTR直接结合从而下调FNDC3B，通过Westernblot验证了MMP11可能为let-7f-5p的下游靶基因。三，我们使用小干扰RNA技术使FNDC3B下调，发现下调FNDC3B的表达可抑制胃癌细胞的粘附、迁移和侵袭能力，下调FNDC3B还可抑制MMP分子的表达，同时可上调viminten 的表达。本课题旨在验证let-7f-5p与胃癌恶性表型的关系，揭示其影响转移的机制，为胃癌的诊断、治疗和转移预测提供合理依据。