产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)破坏肠上皮紧密连接的分子机制及n-3多不饱和脂肪酸的保护作用研究

Recent studies showed that Clostridium perfringens enterotoxin (CPE)could be used in cancer targeting therapy. However, CPE severely disrupted intestinal tight junction(TJ), which limited its clinical application. The aim of this study is to investigate the mechanism of CPE induced disruption of TJ, and exploit a new method to protect intestinal TJ. We fistly construct the recombined CPE protein. Then we utilized in vivo and in vitro models to demonstrate the influence of CPE on intestinal tight junction structures and functions. During the process, lipid microenviroment and TJ protein localization in memebrane microdomains were studied. Furthermore, the protective effects of n-3 polyunsaturated fatty acids on tight junction microdomains were studied.

研究发现，产气荚膜梭菌肠毒素（CPE）可以作为潜在的肿瘤靶向治疗药物。然而,CPE会导致肠上皮紧密连接(TJ)结构破坏,限制了CPE的临床应用。本课题的研究目的在于研究CPE破坏肠上皮紧密连接的分子机制，寻找一种保护肠上皮紧密连接的新方法。我们首先构建并表达含CPE的重组质粒pET-28a-CPE，得到纯化的重组CPE蛋白；然后建立Caco-2细胞模型和在体动物模型，观察CPE对紧密连接结构功能的影响，分析CPE对紧密连接脂肪微环境、紧密连接蛋白分布的影响；探讨CPE破坏肠上皮细胞紧密连接的分子机制。在此基础上，进一步探讨n-3 多不饱和脂肪酸对肠上皮紧密连接结构的保护作用及相关机制。

1.项目背景：近期研究显示产气荚膜梭菌肠毒素（CPE）有希望成为新型的肿瘤靶向治疗药物，但CPE的肠毒性限制了其临床应用。降低其肠毒性、保护肠上皮间紧密连接成为了应用CPE必不可少的前提，新型重组融合蛋白C-CPE-TNF是CPE一种新的应用方式。本课题通过体外细胞实验，验证CPE和重组融合蛋白C-CPE-TN对胃癌细胞的杀伤作用，研究C-CPE-TNF对肠上皮间紧密连接的影响及相关机制，以及n-3多不饱和脂肪酸对紧密连接的保护作用。.2.主要研究内容：首先合成C-CPE-TNF基因序列，获得纯化的C-CPE-TNF蛋白。以人胃癌细胞株SGC7901、正常胃粘膜细胞株GES-1为研究对象，采用不同浓度的CPE和C-CPE-TNF分别作用于SGC7901、GES-1，检测C-CPE-TNF处理后各组细胞活性。以人肠上皮细胞Caco2为研究对象，采用不同浓度的C-CPE-TNF作用于Caco2，测量作用前后Caco2的电阻值变化；Western Blot及激光共聚焦法检测C-CPE-TNF处理前后两组细胞紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、CL4蛋白的表达分布情况。最后，采用不同浓度的二十二碳六烯酸（DHA）作用于Caco2，用DHA和C-CPE-TNF共同处理细胞，检测处理前后两组细胞紧密连接结构和紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、CL4的表达分布情况。.3.研究结果：CPE对胃癌细胞SGC7901具有明显的毒性作用。融合蛋白C-CPE-TNF对胃癌细胞SGC7901、肠上皮细胞Caco2具有增殖抑制作用，对细胞间紧密连接结构具有破坏作用，能够增加肠上皮细胞屏障的通透性；可通过降低紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达来破坏肠上皮细胞间紧密连接。DHA可以减轻C-CPE-TNF对这两种紧密连接蛋白的影响，从而保护肠屏障。.4. 科学意义：成功构建质粒 pET-28a-CPE，国内首次获取重组 C-CPE-TNF 蛋白。研究验证了 CPE和C-CPE-TNF 对紧密连接结构的影响，初步阐述其破坏紧密连接的分子机制，并观察到 n-3 PUFA 对紧密连接的保护作用。为将来应用C-CPE-TNF作为新型的肿瘤靶向药物提供了依据。