巨噬细胞在协同肠上皮细胞抗产气荚膜梭菌β1毒素中的作用及其分子机制研究

Clostridium perfringens is an important agent of both enteric and histotoxic infections in humans and domestic animals. These bacteria produce several protein toxins which play key roles in the pathogenesis of diseases. Βeta1 toxin is an important one. Intestinal mucosal epithelial cells are play an important role in mucosal surface epithelial cells are regulating natural and acquired immune system. But single kind cell model did not really reveal pathogenic mechanism for the study pathogen, and revealing a host-pathogen interactions for study pathogenesis of microorganisms have a more important. In this application, we proposed use the co-culture models of macrophage and intestinal epithelial cells and mouse models to explore the inflammatory cytokine changes in vitro and in vivo induced by beta1 toxin, especially Toll-like receptor (TLR) signaling pathway mediated immune response. The molecular mechanism will be performed in macrophages synergistic effect in intestinal epithelial cells anti-toxin induced by Clostridium perfringens β1. The aims of this study will lay a foundation for understanding the mechanism of pathogenesis, as well as preventing the enterotoxemic disease cause by the infection of Clostridium perfringens.

产气荚膜梭菌是引起动物坏死性肠炎、肠毒血症的主要病原菌之一。该菌主要致病因子是菌体产生的外毒素。β1毒素即其中一种主要的致死性毒素。肠上皮细胞在粘膜表面调节自然和获得性免疫系统中扮演重要角色，而目前单一种的细胞模型对于研究病原的致病机理已不能真正揭示病原的致病机理，揭示宿主-病原相互作用对于深入研究病原微生物的致病机理有着更重要的意义。本项目拟利用肠上皮细胞结构模型以及肠上皮细胞与巨噬细胞共培养模型和小鼠体内模型，研究β1毒素诱导肠粘膜上皮细胞及巨噬细胞的炎症相关细胞因子的变化，特别是Toll-样受体(TLR)信号途径介导的免疫反应，研究巨噬细胞在协同肠上皮细胞抗产气荚膜梭菌β1毒素中的作用及其分子机制，可为进一步阐明产气荚膜梭菌毒素的致病机制及制订免疫防控技术奠定重要基础。

产气荚膜梭菌分布广泛，是一种重要的条件性致病菌，可引起人类及动物食物中毒、创伤性气性坏疽、坏死性肠炎和肠毒血症等传染性疾病。β1毒素是由该菌所分泌的一种致死性毒力蛋白，也是该菌感染宿主后导致腹泻、肠炎、肠毒血症，甚至宿主死亡的重要因素。本项目取得以下研究成果：1.利用基因重组技术构建了9个表达β1毒素的重组载体，筛选其中之一进行表达条件优化，去除内毒素后检测其生物毒性，获得了具有生物活性的rCPB1。2.建立了Caco-2单层肠上皮细胞培养模型以及BMDM细胞模型，研究发现rCPB1会导致RAW264.7、BMDM和THP-1巨噬细胞中NLRP3、Caspase1、Gasdmin D、IL-18和IL1β 等细胞中的炎性因子显著上调，透射电镜结果显示， rCPB1处理组中细胞膜破裂，细胞内容物溢出。在利用RNA干扰技术下调了RAW264.7细胞的Caspase1的表达后，发现可减轻rCPB1处理后RAW264.7的质膜的破裂，IL-18和IL-1β等炎性因子的表达比未干扰组有所下调，说明rCPB1可能通过依赖于Caspase 1的经典细胞焦亡途径诱导RAW264.7细胞发生焦亡。结果提示：rCPB1作用巨噬细胞后，可促进NLRP3炎性小体的组装，活化Caspase1，进一步剪切Gasdermin D后形成质膜孔道，导致炎性因子IL18和IL1β的释放，造成巨噬细胞炎性死亡。3. rCPB1作用NCM460和Caco-2细胞时，NLRP3、Caspase1、Gasdmin D、IL18和IL1β 等细胞因子均无明显变化，表明细胞死亡可能不是以焦亡的形式完成的，表明rCPB1可能并不直接造成肠上皮细胞的炎性死亡，而可能通过诱导肠固有层中的巨噬细胞释放IL-1β和IL-18等炎性因子，而炎性因子的释放进一步损害了肠上皮细胞，从而导致坏死性肠炎等疾病。4.获得了部分rCPB1毒素引起的小鼠肠出血模型的结果。5. 利用产气荚膜梭菌β1毒素蛋白中的抗原肽段免疫小鼠，制备并筛选获得了针对rCPB1毒素的单克隆抗体，对其功能开展了研究并建立了间接ELISA方法，为研究rCPB1毒素的致病机理、靶定位研究奠定基础，也为更好的预防检测产气荚膜梭菌提供良好的备选检测产品。