真菌DNA磷硫酰化修饰系统的发掘与功能鉴定

Phosphorothioate (PT) modification of DNA, in which the non-bridging oxygen in the sugar-phosphate linkage is replaced by sulfur, is the first reported physiological modification in the DNA backbone. The dnd gene cluster is widely distributed in the genomes of bacteria and archaea in different habitats and plays a variety of important physiological functions in the cell. However, it is still unknown whether there is a dnd gene cluster in eukaryotes and whether it is functional in eukaryotes. Plasmopara halstedii and Tilletia caries are two plant pathogenic fungi which we identified with dnd homologous genes. In this study, we will first analyze the PT features and map genomic PT sites in these two fungi. We will also aim to elucidate the relationship between fungal Dnd proteins by protein-protein interactions. Meanwhile, we will compare the dnd genes in three domains of life so as to analyze the phylogeny of fungal dnd systems. Collectively, this work will provide insights into the biological significance of DNA PT modification.

近年来，研究者发现了DNA骨架上的第一例生理修饰——DNA磷硫酰化修饰。该修饰由dnd基因簇负责完成，能够以硫原子取代磷酸二酯键上的非桥联氧原子。dnd基因簇在不同生境的细菌和古菌基因组中广泛存在，并且在细胞内发挥着多种重要的生理功能，尽管如此，目前对真核生物中是否存在dnd基因簇以及其是否发挥功能仍然未知。向日葵霜霉病菌和小麦网腥黑粉菌是我们鉴定到的两株含dnd同源基因簇的植物病原真菌。本项目拟以这两株真菌作为研究对象，在解析真菌基因组DNA的磷硫酰化修饰类型和修饰频率的基础上，绘制真菌全基因组范围磷硫酰化修饰位点的精细图谱，鉴定体外蛋白互作揭示Dnd蛋白之间的相互作用关系。另外，通过与细菌、古菌中的DNA磷硫酰化修饰系统比较，分析真菌dnd基因簇在三域系统中的进化历程及迁移路径。为最终揭示DNA磷硫酰化这一独特生理修饰的生物学意义提供重要数据支撑。

近年来，研究者发现了DNA骨架上的第一例生理修饰——DNA磷硫酰化修饰。该修饰由dnd基因簇负责完成，能够以硫原子取代磷酸二酯键上的非桥联氧原子。dnd基因簇在不同生境的细菌中广泛存在，并且在细胞内发挥着多种重要的生理功能，尽管如此，目前对真核生物中是否存在dnd基因簇以及其是否发挥功能仍然未知。Plasmopara halstedii (GenBank: GCA_900000015.1)和Tilletia caries (GenBank: LWDD00000000.2)是我们在NCBI数据库中比对到的含dnd同源基因簇的植物病原真菌。我们对这两株植物病原菌基因组样品经酶解后进行质谱分析，并未观察到DNA磷硫酰化修饰。之后我们分别设计了6对引物对这两株病原菌基因组DNA进行PCR鉴定，结果显示真菌保守基因的鉴定引物均能扩增出目的条带，而dnd基因簇的鉴定引物均不能扩增出目的条带，鉴于这两株菌病原菌的dnd基因簇分别与Enterobacter、Pseudomonas菌属的dnd基因簇近源，推测NCBI中上传的这两株病原真菌基因组的Scaffold序列存在细菌DNA的污染。我们同时研究了与真核生物更近源的古菌类群，发现部分嗜盐古菌中存在DNA磷硫酰化修饰，我们对其中四株菌进行了SMRT测序，揭示了其PT修饰特征及修饰频率，并发现嗜盐菌DNA磷硫酰化修饰基因簇侧翼存在与之关联的限制基因，两者之间的作用机制有待进一步研究。