DNA磷硫酰化修饰中分子识别及其抗氧化机理研究

Up to date, tremendous amount of experimental data for DNA phosphorothioation have accumulated in biochemistry, structural biology, molecular biology, and cell biology. In order to further develop its biomedical applications, three key biological processes for the physiological modification need to be fully understood at the microscopic level: how do the Dnd functional proteins target the specific non-bridging oxygen atom of DNA molecule and transform it to sulfur atom? how is phosphorothioated DNA recognized by the specific nuclease in the restrict-modification system? how can sparse phosphorothioate sites in 0.1-10 kb commit ROS resistance? In this project, we plan to employ state-of-the-art multi-scale computational chemistry, including high-level quantum calculation, force field improvement, and molecular dynamics simulation, to investigate thermodynamics and kinetics of DNA phosphorothioation at electronic, atomic, and molecular levels. We will combine these theoretical studies with both in vivo and in vitro experiments, such as biochemical assay, molecular spectroscopy, chemometrics, metabolomics, etc. to validate these plausible mechanisms of molecular recognition toward ScoMrcA and DndE, and resistant tolerance toward ROS species. Accordingly, we will establish a metabolic model for the PO-PS modification and PS-PO transformation, and unearth its potential biomedical applications of anti-oxidativity and anti-radiation.

细菌DNA磷硫酰化的生化、结构、分子和细胞生物学实验数据日见丰富；为了更好地开发其生物医学应用潜力，该生理修饰的三个关键生物过程微观机理亟待突破：1)Dnd功能蛋白如何靶向DNA磷酸单元中非桥键氧原子并将其转化为硫原子？2)硫修饰位点如何被限制性专一核酸酶识别？3)以及稀疏硫修饰(平均100到10000个碱基长度上有1个硫修饰)如何能够有效抵抗活性氧的进攻？本项目拟利用量子力学、分子力场、动力学模拟等现代多层次计算化学方法，结合生化分析、分子光谱和化学计量学体内和体外实验验证，“干-湿”交叉、系统深入地研究DNA硫修饰生理过程的热力学和动力学问题，特别是在电子、原子和分子等微观水平上重现该化学修饰与ScoMrcA核酸酶和DndE蛋白等功能蛋白的分子识别以及抵抗活性氧的动态过程。在此基础上构建细菌DNA硫修饰、转化和再生的代谢模型，并挖掘其抗氧化抗辐射的潜在生物医学应用。

细菌DNA磷硫酰化的生化、结构、分子和细胞生物学实验数据日见丰富，阐明其关键生物过程微观机理对开发生物医学应用有重要的科学意义。在本项目的资助下，首先通过有机胺阳离子结合DNA的分子光谱实验证明了广为流传的磷硫酰化核酸分子与碱性氨基酸残基之间的静电相互作用在PT-DNA特异性分子识别中并非主导；其次，利用在ScoMrcA核酸酶的共晶结构为入手点，对照分子生物学公共数据库中非天然硫修饰核酸与靶标蛋白复合物的三维结构信息，通过热力学积分计算、经典分子动力学模拟、高阶量子化学等现代多层次计算化学方法阐明了细菌PT-DNA特异性结合的物化本质来自天然PT-DNA与其功能蛋白之间独特的“硫键-疏水”的协同识别机制；在抗氧化生物功能研究上，以免疫分子过氧亚硝酸PN为抗性靶标，利用硫修饰细菌、质粒等在过氧亚硝酸供体下开展了体内体外抗氧化实验，发现了硫修饰细菌具有抵抗免疫系统过氧亚硝酸的能力，DNA电泳实验说明了PT-DNA可以在中等浓度氧化条件下显著地保存了自身DNA的完整性，LCMS实验进一步证实了其“硫-氧”转化效率与其碱基序列有关，通过时间依赖反应动力学分子光谱实验和酪氨酸PN双聚荧光实验测定了PT-DNA抵抗PN能力与谷胱甘肽等相近。我们进一步开展了多细胞生物线虫实验来挖掘肠道硫修饰微生物组学与宿主之间的生理效应，发现了进食硫修饰细菌的线虫不但活性氧水平被抑制，而且寿命更长、神经反应更活跃，RNAseq生物信息学分析表明PT-DNA可能通过核酸-蛋白相互作用介入了线虫的胰岛素样信号传导系统。最后，我们利用高阶量子化学研究了电泳检测中常用的碘切反应，阐明了碘分子与硫之间的卤键相互作用是碘切稀疏硫修饰DNA时高化学选择性的分子基础，提出了Tris分子介入了DNA双链水解反应以及前人单分子研究的碘切效率问题。分子识别机制已经在SBDspr研究中得以验证，并有望开发出基于PT-DNA引导的SBD基因剪切分子机器。本项目的研究结果还为抗氧化抗衰老天然硫修饰核酸药物发现和PT-DNA单分子碘切化学奠定了理论基础。