生殖支原体GlpK和GlpO定位及酶活性与细胞毒性研究

支原体中至今未发现类似于毒素、侵袭素、溶细胞素等典型的毒力因子，然而在甘油作为碳源的生长条件下对宿主细胞具有较强的毒性作用。因此，支原体可能通过内源性结构及其代谢作为毒性效应器从而发挥其致病作用。为进一步证实该设想，我们拟通过同源性选取生殖支原体（Mg）甘油代谢的两个主要活性酶GlpK和GlpO，检测GlpK的酶活性及活性是否依赖于HPr蛋白的磷酸化，通过Western blotting和免疫电子显微技术分析GlpO的定位情况，同时检测GlpO的氧化酶活性，应用转座子Tn4001同源重组方法建立GlpK和GlpO功能缺失株及抗体抑制实验，探讨GlpK和GlpO对甘油代谢下过氧化氢的产生、细胞毒性及宿主细胞内氧化应激的影响，以明确GlpK和GlpO对宿主细胞毒性的调控作用。本项目的完成不仅能丰富Mg代谢相关的新理论和新知识，而且可能为其它微生物的致病机制研究提供新的模型和方向。

本项目按照申请要求选取Mg甘油代谢途径中两个主要的活性酶GlpK和GlpO，探讨GlpK和GlpO对宿主细胞毒性的调控作用。（1）PCR扩增出1 524 bp目的片段，双酶切和测序证实成功构建出pGEX6p-1/GlpK重组质粒，成功表达了83 kDa的可溶性目的蛋白，纯化目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得pAb，效价可达1:16 000；GST-GlpK融合蛋白经酶切后，纯化出57 kDa的GlpK靶蛋白，测定其甘油激酶活性为1.73 U/mL，且随温度和pH值升高而升高。（2）PCR扩增出1 152 bp目的片段，双酶切及测序证实成功构建出pGEX6p-1/GlpO重组质粒，成功表达出68 kDa的可溶性目的蛋白，纯化后目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得pAb，其效价为1∶32 000；GST-GlpO融合蛋白经酶切后纯化出42 kDa的GlpO靶蛋白，测定其3-磷酸甘油氧化酶活性为4.26 U/mL，40℃和pH 7时活性最高；GlpO蛋白在Mg胞膜和胞浆中均表达，但大部分位于胞浆中。（3）电转化后未筛选出GlpK和GlpO突变株；在葡萄糖下Mg生长迅速，在未加碳源或甘油下生长缓慢；甘油组和抗GST-GlpK抗体组Mg产生的H2O2明显高于未加甘油组和抗GST-GlpO抗体组；甘油组和抗GST-GlpK抗体组的HeLa细胞存活率明显低于未加甘油组和抗GST-GlpO抗体组。以上结果表明甘油代谢下GlpO参与到Mg对宿主细胞的细胞毒性作用，阐述了一种Mg涉及到甘油的摄取和代谢的全新致病机制，也为其它微生物的致病机制研究提供新的模型和方向。