绵羊肺炎支原体甘油代谢酶GlpO功能研究

The glycerol metabolic pathway and the generation of its metabolic production are the important mechanism of mycoplasmas to cause hosts damage. On the basis of preliminary analysis of the genome of mycoplasma ovipneumoniae Y98 strain, the proposal intends to clone its putative glycerol metabolism-related genes glpO and express recombinant protein GlpO.Then,we use western blot and Electron microscopy,combined with biological information analysis, to determine intracellular localization of GlpO.Furthermore, by using the assay of enzyme activity of GlpO, the test of the generation and inhibition of H2O2, the detection of oxidative stress caused by H2O2,we attempt to define the oxidase function of GlpO from mycoplasma ovipneumoniae Y98 strain, the role of GlpO in the glycerol metabolic pathway and cytotoxic effect.The proposal will contribute to study the mechanism of pathopoiesis of Mycoplasma ovipneumoniae.

研究认为，甘油代谢途径及其代谢产物的产生是支原体导致宿主损伤的重要机制。本课题拟在前期对绵羊肺炎支原体Y98株基因组序列测定及分析的基础上，克隆其可能的甘油代谢相关基因glpO，构建其突变体分泌型表达载体，表达其重组蛋白GlpO；参考生物学信息分析，结合western blot、电镜技术，对GlpO定位进行研究；进一步利用酶活性分析、H2O2的产生与抑制试验、细胞氧化应激检测，明确绵羊肺炎支原体Y98 GlpO的氧化酶功能及其与甘油代谢、H2O2形成及靶细胞损伤之间的关系。以上研究的开展，将为绵羊肺炎支原体致病机制研究奠定基础。

绵羊支原体肺炎又称绵羊传染性胸膜肺炎，是由绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)引起的高度接触性呼吸道传染病。该病可见于绵羊和山羊，也可感染野生动物如大角羊等，是一种世界性的传染病。对1-3 月龄的羔羊有较高的感染率和致死率，尤其在某些种羊场中，绵羊支原体肺炎流行严重，发病率达2%-10%，死亡率高达100%。. MO属柔膜菌纲、支原体目、支原体科、支原体属。目前认为，柔膜菌是能够独立生存的、基因组最小的生物体。对于柔膜菌的分析可以使我们得以探讨自然界中最小的生命形态，具有一定的普遍意义。. 碳代谢与柔膜菌的致病机制密切相关。在对肺炎支原体、丝状支原体丝状亚种SC 型（M.mycoides subsp. mycoides SC）的研究中均认为甘油是支原体的主要碳源，且其代谢产物H2O2 是该菌的主要致病因素。MO有关甘油代谢的研究目前尚属空白。因此，本项目在MO Y98 株（ATCC29419）基因组学测定及分析的基础上，对该菌可能的甘油代谢基因GlpO 功能进行了研究：. 根据MO Y98株glpO基因序列，对glpO密码子进行优化后，构建了其原核表达载体，获得了其重组蛋白GlpO，大小约为44KD；制备了抗GlpO抗体、纯化获得了抗GlpO IgG；采用western blot、免疫荧光技术、电镜技术对GlpO 定位进行了研究，证明其为膜蛋白；酶活性分析表明，GlpO重组蛋白可催化G3P产生H2O2，证明其具有甘油-3-磷酸氧化酶活性，且H2O2的产生水平与G3P成正相关；MO菌体催化底物G3P产生H2O2水平可被GlpO抗体抑制，表明MO产生H2O2与GlpO相关；明确了GlpO具有FAD结合位点，且其催化G3P产生H2O2的浓度与FAD含量成正相关；获得了GlpO FAD结合位点缺失突变体----GlpO△FAD及该位点单个Gly15、Gly17、Gly20缺失突变体----GlpO△Gly15、GlpO△Gly17、GlpO△Gly20；体外氧化酶活性检测实验表明，上述突变体均不再具备催化G3P产生H2O2的能力；通过细胞水平检测及动物毒力实验检测表明，与GlpO相比，突变体对于靶细胞的存活及小鼠肺脏的毒力的影响均显著降低。研究结果为MO致病机制研究及免疫预防等提供理论基础。