基于DNMT3A R882突变位点的靶向药物筛选及其作用机制研究

Hematopoietic stem cell (HSC) generates all blood cells and itself, which is called self-renewal. During this process, HSCs accumulate DNA damage and mutation. Although most of these mutations are synonymous, a few of them affect the function of HSC in terms of the adaptability to local environment, self-renewal, proliferation or transformation to cancer cells. Recent studies reveal that the variation of DNMT3A R882 is a founder mutation of hematologic malignancies and a risk factor of leukemia. In this study, we are going to screen for inhibitors targeting hematopoietic cell carrying DNMT3A R882 mutation. Furthermore, we also plan to disclose the molecular mechanism behind the active compounds by using DNMT3A R878H mutated mouse model. Our study will be of great importance in scientific exploration and clinical treatment to leukemia.

造血干细胞(HSC)能够生成所有血液细胞，并且复制自己。HSC在自我复制以及分化成下游血液细胞的过程中累积了DNA突变，虽然大部的突变都是无意突变，然而有极少部分突变影响了HSC的功能。HSCs为适应环境的变化而自我更新能力增强，进而获得更多的DNA突变，从而易引发病变。近些年来，大量研究表明DNA甲基化转移酶DNMT3A R882突变会引起HSC克隆性增生，是白血病的易感因子。本研究将以DNMT3A R882突变为一个全新的药物靶点，结合多种高通量筛选技术与药物合成技术，拟筛选对该靶点具有高亲和性、对DNMT3A R882突变细胞具有强抑制性生物活性的小分子化合物，并利用多种突变细胞系与DNMT3A R878H突变小鼠模型进一步深入探讨药物作用的分子机制。此研究将对同类型研究提供重要的参考，同时对克隆性增生类白血病的预防与治疗产生重要的影响，有广阔的应用前景与重要的社会意义。

DNMT3A（DNA methyltransferase）为甲基化转移酶。近年来，通过对大规模人群的临床血液样本进行高通量测序，发现DNMT3A为突变频率最高的基因，并且该突变尤其在老年人群中高发。DNMT3A突变主要发生在其甲基化功能结构域的第882位的精氨酸，DNMT3A突变驱动的克隆性造血是引发髓系白血病和总生存期缩短的危险因素。但目前DNMT3A突变在衰老相关克隆性造血中的作用机制并不清楚，也还没有对应的小分子抑制剂的报道。.为解决以上问题，我们构建与DNMT3A R882H同源的DNMT3A R878H条件性突变小鼠，并将年轻的R878H骨髓细胞移植到年轻和年老受体小鼠中，以评估衰老骨髓对于R878H驱动克隆性造血的影响。然后，用LPS诱导的炎症模型模拟衰老骨髓中的炎性微环境对R878H驱动的克隆性造血的影响，并用细胞因子芯片鉴定老年骨髓中的主要炎症因子。我们还用体外和体内实验对R878H驱动的衰老相关克隆性造血的分子机制进行了探讨。此外，我们构建了DNMT3A R882H细胞系，并将其用于靶向DNMT3A R882H的小分子抑制剂的高通量筛选。.我们观察到DNMT3A R878H特异性地使造血干细胞数目扩增，且衰老的骨髓和LPS诱导的炎症均可以促进R878H驱动的克隆性造血。此外，DNMT3A R878H导致造血干细胞及祖细胞抵抗TNFα诱导的损伤，且衰老骨髓中上调的TNFα信号是促进R878H细胞克隆性扩增的主要外部驱动力。分子机制上，R878H细胞通过抵抗由TNFα诱导的、RIPK1-RIPK3-MLKL介导的细胞程序性坏死获得生长优势，进而导致R878H驱动的克隆性造血的发生。通过高通量药物筛选，我们发现冬凌草甲素可以通过同时激活细胞凋亡和细胞程序性坏死抑制DNMT3A R882突变白血病细胞的生长和抑制R878H HSC的克隆性扩增。.本论文系统性地从DNMT3A R878H小鼠模型的构建，到DNMT3A R882突变引发衰老相关克隆性造血的机制研究，再到抑制DNMT3A R882突变驱动的克隆性造血的小分子抑制剂的筛选，对DNMT3A及其他相关突变驱动的克隆性造血及白血病研究具有一定的指导意义，为寻找相关突变诱发的白血病与克隆性造血的潜在小分子抑制剂提供参考。