基于“阴平阳秘”理论研究龟鹿二仙胶经Smad3介导的骨稳态平衡抗骨质疏松机制

Disorders of bone homeostasis is the fundamental mechanism of osteoporosis which is closely related to the theory of Yin-Yang balance in TCM. During the process of osteoporosis, it is not clear what is the key factor of maintaining the "Yin ping yang mi" which is the key factor of mediating bone homeostasis. Previous studies have found that classical kidney-tonifying herbs promoted the synthesis of type I collagen by up-regulating the expression of TGF-β/Smad signal pathway. Smad3 plays an important role in promoting the synthesis of type I collagen, which may be the direct target of Chinese medicine. Based on the theory of Yin-Yang balance, we designed experiments to study the mechanism of Smad3 – mediated coupling of osteoblast-osteoclast cells. We also designed experiments to investigate the cross-talk mechanism of Smad3 in coupling of osteoblast-osteoclast cells. The aim of this study to clarify the mechanism of multi-target and multi-channel regulation in the process of anti-osteoporosis of kidney-tonifying herbs. We also want to reveal the mechanism of anti-osteoporosi of kidney-tonifying herbs provide theoretical basis for the treatment of osteoporosis with TCM.

骨质疏松症的根本发病机制在于骨稳态失衡，骨稳态与中医阴阳平衡理论具有微妙的关联性。在骨质疏松症的进程中，维持“阴平阳秘”的关键，即介导骨稳态平衡的关键因素尚未明确。我们前期使用成骨细胞/大鼠/斑马鱼模型开展了研究，发现龟鹿二仙胶可促进成骨细胞合成I型胶原蛋白，其机制是通过上调TGF-β/Smad信号通路中TGF-β、Smad3、P-smad3的表达来实现的。文献研究提示Samds不仅是成骨细胞功能的关键信号分子，也是成骨—破骨细胞耦联的信号通路之间交流的中介。我们分析Samd3可能是介导成骨细胞—破骨细胞之间的耦联的关键因素。因此试图针对龟鹿二仙胶对成骨细胞—破骨细胞耦联的信号通路作用机制进行研究。观察探讨Smad3在成骨细胞—破骨细胞耦联过程中的信号交流作用；分析补肾中药抗骨质疏松的靶点与调控机制；从新的角度审视中医药治疗骨质疏松的机理。

骨质疏松症发病根本机制在于成骨-破骨细胞耦联的骨稳态平衡紊乱。成骨细胞负责骨形成（“阴成形”），破骨细胞负责骨吸收（“阳化气”），成骨-破骨细胞耦联的功能活动与中医阴阳属性生克制化关系一致。中药龟鹿二仙胶补肾健骨、调和阴阳，临床治疗骨质疏松症疗效明确。然而，骨稳态中成骨（阴）与破骨（阳）如何沟通交流？病理状态下如何调整阴阳而治疗骨质疏松症？成骨-破骨细胞间存在TGF-β/Smad3、OPG/RANK/RANKL等信号通路交互活动（crosstalk），Smad3可能是介导成骨-破骨细胞“沟通阴阳”的关键因素，如果缺失Smad3中介作用，信号通路crosstalk是否发生中断？龟鹿二仙胶还能否发挥治疗效果？为解决上述问题，我们基于中医“阴平阳秘”理论指导，应用龟鹿二仙胶干预体外培养成骨/破骨/Smad3-/-成骨细胞，建立成骨/Smad3-/-成骨-破骨细胞共培养体系进行实验，对野生型/Smad3-/-小鼠骨质疏松模型进行干预，综合运用CCK8/流式细胞术/ TRAP染色/骨板吸收/WB/qPCR/ELISA/Micro-CT/IHC等实验技术进行深入研究。研究发现，龟鹿二仙胶存在促进成骨细胞骨形成、抑制破骨细胞分化与骨吸收的双向调控作用，该作用与其调控TGF-β/Smad3、OPG/RANK/RANKL信号通路交互及成骨、破骨细胞诱导因子有关；缺失Smad3基因，龟鹿二仙胶对成骨-破骨细胞TGF-β/Smad3与OPG/RANK/RANKL信号通路crosstalk调控作用减弱，促进骨形成作用减弱，但仍表现破骨细胞抑制作用。体内实验结果显示，龟鹿二仙胶从骨微结构、骨密度、组织病理、血清骨代谢、生物力学等多角度证实其抗骨质疏松效应；成骨细胞缺失Smad3基因，龟鹿二仙胶仍发挥一定抗骨质疏松效应，但对成骨-破骨细胞TGF-β/Smad3与OPG/RANK/RANKL信号通路crosstalk及骨形成-骨吸收分子表达调控作用减弱，体内体外实验结果较一致。实验结果从多角度证实成骨-破骨细胞TGF-β/Smad3与OPG/RANK/RANKL信号通路crosstalk的可能分子机制及Smad3的重要中介作用，阐明补肾中药抗骨质疏松中多靶点、多途径调控机制，揭示中医“阴平阳秘”理论指导防治骨质疏松症的内涵，为中医药抗骨质疏松相关应用提供了依据，具有重要的学术价值。