DNMT3A R882位点突变对苯致遗传损伤的甲基化机制研究

Benzene (BZ) is a well-known established human carcinogen, leading to all types of leukemia mainly including acute myelocytic leukemia (AML). DNA-methyltransferase 3A (DNMT3A) is an enzyme that catalyzes the transfer of methyl groups to specific CpG structures in DNA, and the mutation rate in R882 site is more than 20% in AML patients, and is tightly related with leukemia and it’s prognosis. Our preliminary studies show that genetic damage in R882 site mutation groups was higher than control workers, and the DNA methylation level changed in mutation group. Then, how do R882 site mutation in DNMT3A causing the genetic damage? And how the role of the changing DNA methylation level in benzene exposed workers?. In this proposal, pyrosequencing and cytokinesis block micronucleus test (CBMNT) is applied to detect the mutation in Dnmt3A R882 site and genetic damage. Moreover, DNA bisulfite processing, pyrosequencing, methylation specific PCR (MSP), bisulfite sequencing PCR (BSP) and high Resolution Melting (HRM) are used to detect the methylation level of transcription initiation region in three pathway of DNA damage repair genes (DRG), including base excision repair (BER), nucleotide excision repair (NER), mismatch repair (MMR). Those can be used to investigate the mechanism of DNA methylation in DRGs induced by R882 site mutation, and explore the pathogenesis of genetic damage reflected by cytokinesis-block micronuclei. The results from our study can provide a new direction for health surveillance of workers exposed to benzene.

苯是确定的人类致癌物，主要导致以AML为主的各型白血病。DNMT3A是甲基化调控的关键酶，其R882位点突变率在AML中较高，约20%，且与预后存在关联。本课题组研究发现，R882位点突变型苯作业工人遗传损伤率高于非突变型对照人群，且苯作业工人外周血DNA甲基化水平发生改变，那么R882位点突变对苯致遗传损伤的机制是什么？DNA甲基化水平改变在其中的作用如何？.为初步探索上述问题，本项目拟采用焦磷酸测序和胞质阻滞微核实验对苯作业工人及其对照的DNMT3A R882位点突变和遗传损伤情况进行检测，进而应用亚硫酸氢盐处理、焦磷酸测序、MSP和HRM等法检测DNA损伤修复通路BER、NER和MMR的关键基因转录起始区甲基化水平，寻找并确定R882突变是否对DNA损伤修复基因存在表观遗传学调控，探索其影响苯致遗传损伤机制，为苯致遗传损伤的发病机制提供理论依据，也为苯作业工人的健康监护提供新的方向。

苯是工业生产中一种主要的产品和原料，能够导致苯中毒和白血病等疾病。本项目拟在前期建立的职业现场基础上，结合职业体检进行流行病学调查和样本采集，进而验证苯致遗传损伤与DNMT3A R882位点突变的关联性，并初步探索R882位点突变对苯致遗传损伤的甲基化机制。.本项目前期于温州六个鞋厂进行了职业流行病学调查，通过问卷调查收集基本资料和健康体检及其双核微核检测，收集苯作业工人396例。于2017年又去进行鞋厂工人的随访，进行体检和血常规检测职业接触工人300例。2018年又在上海对197名苯作业工人进行流行病学调查，进行血象、双核微核和彗星检测。发现苯作业工人双核微核指标要比外周血白细胞降低更敏感，能够更好地提示遗传损伤。苯接触组彗尾长度和宽度高于对照组。此外本项目检测苯接触组甲基化水平，发现总体甲基化水平显著低于对照组。采用甲基化芯片对苯中毒患者进行全基因甲基化检测，发现部分DNA损伤修复基因甲基化水平升高，对其中的MGMT、hMLH、CREB5、CSF3R和F2R启动子区甲基化水平进行验证，测定其mRNA水平。发现MGMT和hMLH在苯接触组甲基化水平高于对照组，并且体外细胞应用苯醌和氢醌染毒出现类似结果。研究发现苯作业工人CSF3R启动子区甲基化水平升高，导致其mRNA水平表达降低，导致中性粒细胞生成降低。其次，检测DNMT3A（rs36012910，rs1550117和R882）和DNMT3B（rs1569686，rs24909和rs2424913）的单核苷酸多态性。发现苯作业工人R882突变等位基因（R882H和R882C）中的双核微核率高于野生型，总体基因组甲基化水平低于野生型。再次检测DNA损伤修复基因MMR、NER和BER通路的11个位点多态性，发现rs1130409突变等位基因（GG+GT）与低总体DNA甲基化相关，其微核率显著高于野生型。.总之，在我国职业卫生标准下，依然存在苯中毒和遗传损伤，苯作业工人外周血总体甲基化水平低于对照组。DNMT3A和DNMT3B基因突变能够导致总体甲基化水平改变，尤其是R882位点突变型与低甲基化相关，DNA损伤修复基因甲基化水平升高，导致遗传损伤更严重。苯作业工人外周血的甲基化改变可作为苯接触的潜在生物标志物。