鸭TRIM25 介导RIG-I信号通路泛素化的调控机制

Studies have proposed that the RIG-I gene (present in ducks and absent in chickens) might underlie the differences in avian influenza virus immunity between chickens and ducks. However, it remains unclear how the RIG-I gene works in antiviral innate immunity. It is known that ubiquitination has important roles in regulation of the immune pathway extensively. Our previous work found that the duck ubiquitin ligase TRIM25 involved in the activation of RIG-I signaling pathway. We speculate that TRIM25-mediated regulation of RIG-I signaling by ubiquitination in duck. In this study, the 5'ppp-dsRNA is used to mimic virus infection in vitro. Firstly, the TRIM25-mediated ubiquitination of target genes is confirmed on basis of identification of the position in RIG-I signaling. Furthermore, the ubiquitination sites of the target gene are explored and the ubiquitination sites of TRIM25-mediated are verified by detecting IFN-β production. These studies will understand further the molecular mechanism of TRIM25-mediated regulation of RIG-I signaling by ubiquitination, and provide a scientific basis of different sensitivity of the influenza virusbetween chickens and ducks.

研究表明，鸭的RIG-I基因（鸡基因组缺失）是鸡和鸭对流感病毒敏感性差异的重要原因，但鸭RIG-I在体内是如何发挥作用，其机制不清楚。大量研究证实，泛素化修饰广泛参与了免疫通路调节，本课题组前期研究也发现鸭泛素连接酶TRIM25直接参与RIG-I信号通路的激活。因此推测TRIM25可能介导RIG-I信号通路的靶分子泛素化，活化信号通路，发挥抗病毒效应。基于此，本项目拟采用5'ppp-dsRNA体外模拟病毒感染（RIG-I能优先识别禽流感等病毒的5'ppp RNA序列），确定TRIM25在RIG-I信号通路中的作用位置（靶分子），进一步揭示 TRIM25介导的靶分子泛素化水平的影响，重点探索TRIM25介导的靶分子泛素化作用位点及其对IFN-β产生的影响。研究将全面阐明鸭TRIM25 介导的RIG-I信号通路泛素化调控机制，也为进一步探明鸡和鸭对禽流感敏感性差异提供一定的科学依据。

禽流感特别是高致病性禽流感严重阻碍了养禽业的发展。RIG-I基因在抵抗禽流感等病毒中起着十分重要作用。前期研究已发现TRIM25参与RIG-I 介导的信号通路的调节，并鉴定出其差异表达基因在RIG-I信号通路显著富集。据此我们假设TRIM25介导RIG-I信号途径促进IFN-β活性，进而影响抗病毒效应。为了验证这一假说，本项目首先探究TRIM25在RIG-I信号通路中的调控作用；阐明了TRIM25 介导的RIG-I信号通路调控的分子机制。研究结果不仅揭示了鸭TRIM25 介导的RIG-I信号通路调控分子机制，同时也为禽流感疾病的防控提供一定的理论依据。.1、鸭TRIM25基因的获得及组织特异性表达分析.得到TRIM25 cDNA全序列，包括16bp的5'UTR、2052bp的ORF和279bp的3’ UTR。TRIM25在肾、肝和脾中高度表达。经5'ppp dsRNA 刺激后TRIM25的表达水平表现为迅速升高后降低的趋势。.2、TRIM25参与RIG-I 介导的信号通路的调节，促进IFN-β的表达.过表达TRIM25在LPS和5'ppp dsRNA刺激下激活NF-κB和IRF1转录活性，促进IFN-β的产生。此外，TRIM25的 B-Box和SPRY结构域能显著激活IFN-β的转录活性。.3、TRIM25参与RIG-I信号通路调控从而促进RIG-I信号通路下游基因的表达.检测过表达TRIM25在5’ppp dsRNA的刺激下不同时间点RIG-I信号通路 mRNA的表达水平。过表达TRIM25经5’ppp dsRNA刺激显著上调IFN-β、RIG-I和MAVS的表达，同时RIG-I信号通路的下游基因表达水平也呈上升趋势。.4、蛋白质组学和泛素化组学分析 5’ ppp dsRNA激活的抗病毒信号通路中相关分子的响应.通过蛋白质组学分析发现差异蛋白在RIG-I样受体信号通路（apla04622）显著富集。泛素化修饰组学则5’ ppp dsRNA刺激鸭胚胎成纤维后TRIM25的第201位赖氨酸泛素化位点显著上调。.综上所述，TRIM25通过激活IRF1和NF-κB转录因子，触发I型干扰素的产生，从而激活RIG-I信号通路，同时通过TRIM25自泛素化调控RIG-I信号通路，促进TRIM25在RIG-I 介导抗病毒信号通路中作用。