鸭CD8α基因甲基化及其对雏鸭肝炎作用的研究

当前鸭的病毒性疾病逐年增加，并日趋复杂，给养鸭业造成了巨大的经济损失，大量研究证明：DNA甲基化与疾病密切相关。本研究以雏鸭肝炎病毒（DHV）感染雏鸭为动物模型，选择前期研究筛选的雏鸭病毒性肝炎应答基因CD8α为候选基因，采用焦磷酸测序技术检测雏鸭肝炎病毒易感组、非易感组和对照组duCD8α基因在肝组织DNA甲基化状态的差异，利用荧光定量PCR技术和Western blot技术比较三组鸭的mRNA和蛋白的表达量，深入探讨duCD8αDNA甲基化对其mRNA和蛋白的表达的影响；同时通过建立雏鸭肝炎病毒接种的鸭原代肝细胞模型，在培养基中添加甲基化酶的抑制剂（5-Aza-dC），在细胞层次上研究去甲基化能否恢复其基因和蛋白水平的表达。研究为初步解析duCD8α甲基化对雏鸭肝炎致病的生物学功能提供重要证据，也为寻求鸭DNA甲基化分子标记提供新的途径。

大量研究证明：DNA甲基化与疾病密切相关。CD8α作为T淋巴细胞表面的重要标志物，在抗病毒感染和细胞免疫体系中起着非常重要的作用。已有研究证实，CD8α基因DNA甲基化的改变受胸腺高移动性型框蛋白和IL4等多种因子影响，从而导致基因表达的变化或异常表达。而关于鸭的CD8α基因表观遗传调控至今尚不清楚。.本研究分别以金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭、绿头鸭和斑嘴鸭的脾脏组织cDNA为模板进行RT-PCR扩增，成功获得了金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭、绿头鸭和斑嘴鸭CD8α 基因CDS区，并对不同禽类（金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭、绿头鸭、斑嘴鸭、家鸡、红色原鸡、斑胸草雀和火鸡）CD8α基因编码序列进行了进化分析，在胞外区发现了Cys49、Cys119、Cys182 等3个保守性氨基酸残基；在蛋白质级结构上，9条序列的α螺旋和β折叠亦相似；通过RT-PCR和RT-qPCR，检测了CD8α时空表达谱，发现鸭CD8α基因在胸腺、脾、肺和淋巴细胞中表达量较高，免疫组化技术检测结果显示在鸭脾脏白髓区的脾小结和淋巴鞘CD8α蛋白表达丰富；同时采用Ⅰ型雏鸭肝炎病毒和Poly（I:C）接种3日龄雏鸭，发现胸腺、脾、肺等组织CD8α基因总体表现为先上升，48h下降至最低值，后又有上升趋势。.运用基因组步移扩增，成功克隆了鸭CD8α 基因5’端2480bp的片段，包括第一外显子56bp，启动子区2424 bp，通过制备一系列启动子缺失突变体-625/-1 bp，-1110/-1 bp，-1413/-1 bp，-2151/-1 bp），定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中，通过荧光发光仪检测发现，-625～-1110启动子活性最强，且-625～-1 bp 区域和-625～-1110均存在着正调控元件。通过亚硫酸盐测序比较了雏鸭肝炎病毒感染发病组、感染不发病组和对照组血液的CD8α基因的甲基化程度，发现发病组CD8α基因甲基化明显偏高（0.90±0.10），但与感染不发病组0.73±0.15）和对照组（0.77±0.06）差异不显著（P>0.05）。采用MethylFlash整体甲基化定量试剂盒对感染发病组、感染不发病组和对照组整体甲基化水平进行检测，结果发现，感染发病组血液整体甲基化水平要显著高于感染不发病组和对照组（P<0.05），其CD8α基因表达量与血液CD8α甲基化水平