鸭坦布苏病毒与鸭RIG-I样受体介导的信号通路相互作用研究

The infectious disease caused by duck Tembusu virus (DTMUV) was first broken out in Shanghai, Zhejiang in April 2010. Although the diagnostic methods of serology and etiology have been established, the interaction between DTMUV and host innate immune system was still unclear. Our previous studies have demonstrated that RIG-I and MDA5 were involved in the immune response to DTMUV in ducks. In the present proposal, the method of over-expression or siRNA of RIG-I and MDA5, and the technique of firefly luciferase reporter system and real-time quantitative RT-PCR will be used to determine the roles of two receptors in DTMUV induced host innate immune and the ability of them in anti-DTMUV infection. Further study will investigate the roles of non-structural proteins of DTMUV in inhibiting RIG-I and MDA5-mediated signaling pathways to evade the host's immune surveillance by over-expressed of the seven non-structural proteins of DTMUV and effector domain of RIG-I and MDA5 in vitro. This study will be useful to further elucidate the pathogenesis of DTMUV and the mechanism of host immunity and provide a scientific basis for screening of vaccine adjuvants.

鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus, DTMUV）病于2010年4月首先在我国上海、浙江等地爆发。该病的血清学、病原学等主要诊断方法已经成熟，而DTMUV与宿主先天性免疫系统的相互作用还不清楚。前期研究发现鸭RIG-I和MDA5参与DTMUV诱导的宿主免疫反应。本项目拟采用siRNA或超表达RIG-I和MDA5的方法，利用已经建立的萤火虫荧光素酶报告基因系统、荧光定量RT-PCR等技术，阐明RIG-I和MDA5如何参与DTMUV诱导的免疫反应，并确定其是否具有抗病毒感染功能。进一步在细胞中分别过表达DTMUV七个非结构蛋白和RIG-I或MDA5的效应结构域，利用上述技术揭示哪个/些非结构蛋白通过何种方式阻断RIG-I和MDA5介导的信号通路，从而逃避宿主的免疫监视。这将为深入理解DTMUV感染与机体免疫机理及筛选新型抗DTMUV疫苗的免疫佐剂提供科学依据。

鸭坦布苏病毒（DTMUV）于2010年首先在福建、浙江等地的发病鸭场中分离到，主要引起产蛋鸭群产蛋下降、商品肉鸭生长迟缓和神经症状。该病传播迅速，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。目前，对DTMUV的致病性还不清楚，DTMUV感染后诱导的宿主先天性免疫反应以及维甲酸诱导基因I样受体家族（RLRs）在病毒感染过程中的作用更是缺乏了解。. 本项目检测了DTMUV体外感染DEF细胞后RIG-I、MDA5、I型IFNs和部分促炎细胞因子的表达变化，结果如下： RIG-I和MDA5被病毒激活而过量表达，导致IFN-α和IFN-β、抗病毒蛋白OAS以及IL-6、IL-8等的大量表达。上述研究结果说明，DTMUV感染DEF细胞后其抗病毒先天性免疫反应被迅速激活。. 在DEF细胞上分别超表达RIG-I和MDA5的全长及其效应结构域，再感染DTMUV，发现两个受体及其效应结构域均能抑制DTMUV增殖。继而，我们克隆并表达了鸭MAVS基因（duMAVS），通过超表达和RNA干扰证实，duMAVS在DTMUV感染过程中是必需的。此外，DTMUV感染后能进一步刺激RIG-I和MDA5诱导的转录因子NF-κB和IRF-7的产量，说明超表达的RIG-I和MDA5识别DTMUV核酸后能通过NF-κB和IRF-7信号通路激活下游IFN-β。本部分研究初步确定RIG-I/MDA5-MAVS-IRF-7/NF-κB信号通路介导IFN-β参与抗DTMUV的先天性免疫反应。. 为了进一步明确DTMUV通过何种方式拮抗宿主IFN-β的产生，我们分别克隆并构建了病毒7个非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5的真核表达质粒，实验发现，超表达有NS1蛋白的细胞中IFN-β含量较对照组显著下降，表明DTMUV的NS1蛋白在拮抗RIG-I和MDA5的信号通路中起主要作用。进一步地，将NS1和duMAVS的真核表达质粒共转染DEF细胞，转染后24h，通过激光共聚焦观察发现，DTMUV的NS1和duMAVS在细胞中存在共定位现象，初步确定DTMUV的NS1蛋白可能是通过与duMAVS的相互作用抑制了RLRs信号通路。. 本项目的研究结果将为深入理解DTMUV感染与机体免疫机理及筛选新型抗DTMUV疫苗的免疫佐剂提供了科学依据。