VPS28基因介导泛素化信号通路调控奶牛乳脂合成的分子机制

Milk fat content is an essential measure of milk quality. Using GWAS (genome-wide association study) and targeted sequencing of specific regions, a novel mutation (C-58T) in 5'UTR of VPS28 gene was found to be significantly associated with milk fat percentage ( P=7.32E-60 ). Mammalian VPS28 (vacuolar protein sorting 28 homolog) as a subunit of the ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport), is involved in ubiquitin-lysosome and ubiquitin-proteasome mediated degradation of ubiquitinated proteins. This suggests that VPS28 gene may regulate milk synthesis by mediating ubiquitination in bovine. In this project, the combination of milk fat synthesis related proteins with ubiquitin will be identified by CO-IP and BiFC experiments. Then, the functions of the VPS28 gene will be verified in BMEC in vitro by gene knockdown and over-experssion techniques. Finally, the functions of the mutation C-58T in the VPS28 gene will be validated by CRISPR/Cas9-mediated site directed mutagenesis. This project will illuminate the molecular mechanism of regulation of VPS28 on milk synthesis in dairy cattle through mediating the ubiquitination signaling pathway, provide evidences of the relationship between milk fat synthesis and ubiquitination, and lay a foundation for molecular breeding in dairy cattle in the future.

乳脂含量是衡量牛奶品质的重要指标。申请人前期的GWAS及目标区域捕获测序研究发现VPS28基因5'UTR（5'un-translated region）的突变位点（C-58T）与乳脂率存在极强关联（P=7.32E-60）。VPS28是内体蛋白分选转运装置ESCRT的一个亚单位，通过泛素-溶酶体和泛素-蛋白酶体系统调控细胞中蛋白质的选择性降解过程。这提示VPS28可能是通过泛素化信号通路影响乳脂合成相关蛋白的降解进而调控乳脂合成。本项目拟首先运用免疫共沉淀和双分子荧光互补技术确定乳脂合成相关蛋白与泛素的结合，然后以牛乳腺上皮细胞（BMEC）为细胞模型，利用基因敲除、基因过表达等手段对VPS28进行效应分析，最后利用CRISPR/Cas9基因定点突变技术对致因突变进行体外功能验证。研究结果将揭示VPS28对乳脂合成的调控机制，为奶牛乳脂性状的分子育种研究提供参考依据。

VPS28是内体蛋白分选转运装置ESCRT的一个亚单位，通过泛素-溶酶体和泛素-蛋白酶体系统调控细胞中蛋白质的选择性降解过程。申请人前期发现VPS28基因与乳脂率存在极强关联，这提示VPS28可能是通过泛素化信号通路影响乳脂合成。本项目首先通过免疫共沉淀技术检测牛乳腺上皮细胞系MAC-T（Mammary epithelial cell line）中乳脂合成相关蛋白与泛素蛋白的结合情况；然后通过过表达、敲降、溶酶体抑制剂和蛋白酶体抑制剂在细胞水平上验证VPS28对乳脂合成的调控，并同时在小鼠模型进行体内验证。结果发现，乳脂合成相关基因CD36、ADFP可以与泛素蛋白直接结合；构建慢病毒过表达载体对VPS28基因进行过表达后，MAC-T细胞中VPS28、CD36、泛素化蛋白及蛋白酶体活性均显著上调，但ADFP及甘油三酯水平显著下调；构建慢病毒敲降载体对VPS28基因进行敲降后，VPS28、蛋白酶体活性显著下调， CD36、ADFP、泛素化蛋白及甘油三酯水平显著上调；利用溶酶体抑制剂抑制溶酶体活性后，MAC-T细胞中VPS28、CD36、ADFP、泛素化蛋白和蛋白酶体活性分别显著上调，甘油三酯下调；利用蛋白酶体抑制剂抑制蛋白酶体活性后，细胞中CD36、ADFP、VPS28、泛素化蛋白质和甘油三酯水平均显著上调；在小鼠体内，腹腔注射VPS28慢病毒敲降载体、溶酶体抑制剂和蛋白酶体抑制剂后，小鼠的肝脏、血液和乳腺组织中的甘油三酯含量显著增加，同时乳腺中不饱和脂肪酸水平显著增加，注射VPS28慢病毒过表达载体后出现相反结果。综上所述，VPS28基因能够通过影响泛素化信号通路影响泛素-溶酶体系统或泛素-蛋白酶体系统的功能，调控乳脂生成。本研究揭示了VPS28信号通路对奶牛乳脂合成的调控机制，并提出了泛素化调控乳脂合成的新机制，为奶牛乳脂性状的分子育种研究提供了参考依据；同时本研究首次构建了小鼠模型，为乳脂研究提供了技术参考，并为蛋白酶体抑制剂和溶酶体抑制剂用于奶牛生产性状改良的创新使用提供了参考。