去泛素化酶USP18在鸭RLRs信号通路中调控作用与分子机理

Ducks, as one of the natural hosts of influenza virus, carry a variety of influenza A virus, but almost no symptoms of disease. The reason is that duck has the antiviral signaling pathway of RIG-I like receptors (RIG-I Like Receptors,RLRs) different from chicken. In this previous study, we found that duck deubiquitin enzyme USP18 may participate in the regulation of RLRs signaling pathway, but the mechanism is not clear. Therefore, we hypothesize that duck USP18 may play an antiviral effect by deubiquitination to regulate RLRs signaling pathway. In this project, the mechanism of USP18 involvement in reaction route of RLRs signaling will be explored by 5'ppp-dsRNA challenged. And then the USP18 deubiquitination site will be identified by constructing USP18 mutant. Further analysis will be carried out to investigate the effect of USP18 on the expression of IFN- β in the linker molecules of the pathway, and identify the target molecule of USP18 in the RLRs signaling pathway. Finally, we also will focus on the regulatory mechanism of USP18 on the ubiquitination of target molecules. The results will expand the immune regulation function of USP18 in ducks, which not only help to elucidate the molecular mechanism of duck resistance to avian influenza, but also provide scientific basis for the prevention and control of the disease.

鸭作为流感病毒天然宿主之一，能携带多种A型流感病毒，但几乎不表现疾病症状。其原因在于鸭体内具有与鸡不同的RIG-I样受体（RIG-I Like Receptors，RLRs）抗病毒信号通路。本课题前期发现鸭去泛素化酶USP18可参与RLRs信号通路调节，但调控机理尚不清楚。据此我们提出鸭USP18可能通过去泛素化修饰调控RLRs信号通路，从而发挥抗病毒效应的假说。本项目拟采用5’ppp-dsRNA模拟病毒感染，探讨USP18参与RLRs信号通路的作用途径；通过构建USP18突变体鉴定USP18去泛素化活性位点；进一步解析USP18对通路中各接头分子介导IFN-β表达的影响，识别USP18在RLRs信号通路作用靶分子；并重点研究USP18对靶分子泛素化水平的调控机制。研究结果将拓展USP18在鸭体内免疫调节功能，这不仅有助于阐明鸭抗禽流感的分子机理，还可为该疾病的防控提供一定的参考依据。

本项目采用5’ppp-dsRNA模拟病毒感染，探讨USP18参与RLRs信号通路的作用途径，并进一步识别USP18在RLRs信号通路作用靶分子。.1. 过表达/敲低USP18在本底和5’ppp dsRNA，LPS刺激下抑制/促进IRF1，NF-κB的转录从而下调/上调IFN-β的表达 .过表达duUSP18可抑制5’ppp dsRNA，LPS刺激的条件下NF-KB和IRF1的转录活性和IFN-β生成；敲低USP18则表现为相反趋势。因此USP18可通过抑制NF-KB和IRF1的转录活性下调IFN-β表达。.2. 过表达/敲低USP18在5’ppp dsRNA刺激下抑制/促进RLR信号通路基因的表达.过表达duUSP18显著抑制MAVS和RIG-I的表达，同时IRF1，NF-kB信号通路的下游基因在5’ppp dsRNA的刺激下也显著降低，敲低USP18则表现为相反趋势。研究证实了USP18通过IRF，NF-kB信号通路参与病毒诱导的负调控IFN-β的作用。.3. USP18的C66, H313, H321抑制IFN-β转录.利用点突变技术将酪氨酸和谷氨酰胺以各种组合突变为半胱氨酸和组氨酸。与野生型相比，C66Y / H313Q / H321Q突变体对IFN-β的抑制作用明显受损，同时发现USP18 C66Y，H313Q，H321Q突变体大大降低了USP18对IFN-β的抑制，特别是C66，H313位点。因此，duUSP18的组氨酸和半胱氨酸对介导RLR-IFN通路至关重要。.4. 鸭USP18的互作靶向蛋白鉴定与功能分析.免疫沉淀结合质谱分析，共鉴定出300个与USP18相互作用的蛋白，进一步采用IP结合WB方法，发现USP18与STAT3存在相互作用，过表达USP18，可抑制STAT3的表达。.5. 5’ppp dsRNA感染激活RLRs先天性免疫信号通路泛素蛋白分子.利用泛素化修饰组学技术分析5’ppp dsRNA刺激鸭胚胎成纤细胞发现蛋白有754个位点的修饰水平发生上调，812个位点发生下调，通过对差异修饰蛋白进行KEGG分析，我们发现MAVS，USPs等赖氨酸泛素化位点发生显著的变化。.综上所述，USP18通过RLR-IFN途径参与病毒诱导的负调控IFN-β信号，研究结果将拓展USP18在鸭体内免疫调节功能。