糖基化信号途径中OGA的双催化功能及调节机制

乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）修饰是最新发现的一种蛋白质翻译后修饰，与Ⅱ型糖尿病、肿瘤等多种疾病的发病机理相关。乙酰葡萄糖胺酶（O-GlcNAcase，OGA）是唯一水解蛋白O-GlcNAc的己糖胺酶。最近研究发现该酶还具有乙酰转移酶的活性，预示该酶可能在糖基化和乙酰化信号传递中起重要作用，但该酶双催化功能的调节机制尚不清楚。.本课题组通过缺失突变发现OGA的糖苷酶功能域位于N端（1-350aa），乙酰转移酶功能域位于C端（700-916aa），后者的活性可能依赖于该酶的翻译后修饰或互作蛋白调节。本项目拟进一步通过嵌合突变、定点突变分析该酶的两个催化结构域；通过多宿主表达和点突变分析磷酸化和糖基化对该酶的调节；利用酵母双杂交、免疫共沉淀等，发现、鉴定OGA的互作蛋白，探讨互作蛋白对该酶的调节，揭示蛋白质磷酸化、糖基化、乙酰化多网络信号调控的发生机制，为相关疾病的靶向治疗提供依据。

乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）修饰是近年来发现的一种存在于细胞核质中蛋白质上的翻译后修饰，它与磷酸化共同调控转录、翻译、信号传导、周期调控、应激反应等多种生理过程。乙酰葡萄糖胺酶（O-GlcNAcase，OGA）是体内唯一水解该修饰的糖苷酶，课题前期研究表明，OGA具有糖苷酶和乙酰转移酶活性两种催化活性，课题实施中利用生物信息学分析、缺失突变、嵌合突变和定点突变技术，定位了两个催化活性结构域的位置和关键氨基酸：糖苷酶区域位于N端（1-350aa），其中 Asp174和Asp175为催化氨基酸，Y69, C215, Y219, N280, D285为与底物结合氨基酸；乙酰转移酶区域位于C端（700-916aa），其中Asp753、Asp884为催化氨基酸，Asp774，Phe789，Cys777为与底物结合氨基酸。通过多宿主表达和点突变分析磷酸化（Ser364Asp）和糖基化（Ser405Tyr）形式的OGA对糖肽和糖蛋白的糖基化水解能力，发现相对于未修饰的OGA，糖基化和磷酸化修饰后的OGA的糖苷酶水解能力大大加强。同时，本项目对OGA进行抗原性和亲水性分析，以大肠杆菌表达的N端1-350aa（sOGA)作为抗原，通过免疫新西兰大白兔制备了可识别多种OGA变体的多克隆抗体，为OGA代谢调控及相关生物学研究提供了基础。总之，通过分析磷酸化和糖基化修饰对OGA功能的改变，揭示了蛋白质磷酸化、糖基化、乙酰化多网络信号调控的发生机制，为相关疾病的靶向治疗提供依据。