狂犬病病毒mRNA加帽酶对病毒致病性和免疫逃避的影响

Rabies is a severe enzootic disease caused by rabies virus. After entering into the host central nerve system, rabies virus can evade the host immune responses.When the clinical signs appear, there is no effective treatment for rabies and its fatality is near 100%. The mechanism for rabies virus to cause disease and evade the host immune responses is still not well understood.The recent studies showed that many viruses could evade the host innate immune responses by mRNA capping.Recently, our group found that there were sevral important enzymes related to mRNA capping within large protein of rabies virus by using bioinformatics. We hepothesize that these mRNA capping enzymes affect the pathogenecity and immune evasion of rabies virus. To prove this hepothesis,we plan to construct recombinant rabies viruses by using reverse genetics, whose conserved amino acid in the important motifs of mRNA capping enzymes will be changed. The effect of viral mRNA capping enzymes on viral transcription/replication, viral pathogenecity and immune evasion will be investigated. This application is the first study focusing on the mRNA capping enzymes of rabies virus and will give a significant contribution to the prevention and clinical therapy for rabies.

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患传染病。狂犬病病毒在进入机体以后，可以逃逸宿主的免疫反应，其发病后死亡率接近100%。由于狂犬病病毒的致病和免疫逃避机制不详，导致发病后无有效治疗措施。最近的研究中发现了病毒通过mRNA加帽来躲避宿主先天性免疫反应的新机制。本课题组在研究中发现狂犬病病毒也有mRNA加帽的现象，并且通过生物信息学发现，狂犬病病毒在L蛋白上分布有多个决定mRNA加帽的酶，我们推测这些加帽酶在病毒致病和免疫逃避中扮演重要作用。为证实该设想，我们通过本课题组已成熟的反向遗传操作系统构建加帽酶关键位点突变的重组狂犬病病毒，研究狂犬病病毒mRNA加帽酶对病毒在体外转录与复制，病毒在小鼠体内致病性及病毒逃逸先天性免疫的影响。本项目首次研究狂犬病病毒mRNA加帽酶对病毒致病性和免疫逃避的影响，为狂犬病的有效防治提供了新思路和新的药物靶点。

狂犬病是由狂犬病病毒（RABV）引起的一种古老的人兽共患传染病。全世界每年约有 59000 人死于狂犬病，我国是狂犬病高发国家之一。由于狂犬病毒的致病机制不详，制约了其临床治疗手段的开发，其发病后的死亡率高达100%。最近的研究表明，病毒的mRNA 加帽过程中的甲基化修饰利于病毒的免疫逃逸。.我们拟通过生物信息学分析，发掘与狂犬病毒mRNA 加帽相关酶的保守位点，通过反向遗传操作构建位点突变的重组病毒。通过体外实验，研究这些关键位点对病毒转录、复制和扩散的影响；同时，研究其对I 型干扰素（interferon, IFN-I）的产生及其敏感性的影响，以及对天然免疫因子IFIT1/2敏感性的影响。在小鼠模型中，我们研究上述关键位点对小鼠致病性及免疫原性的影响。.我们发现狂犬病毒 L 蛋白含有 K-D-K-E 的保守四聚体结构域，将该结构域中的四个关键氨基酸位点 K1685、D1797、K1829和E1867分别进行突变为A，构建了一系列的重组狂犬病毒。体外研究表明，D1797A 和 E1867A 重组突变病毒易突变回复为母本病毒，而 K1685A 和 K1829A 重组突变病毒的遗传性状则比较稳定。K1685A 和 K1829A突变显著降低了病毒的转录与复制；生长曲线结果表明K1685A 和 K1829A重组病毒的增殖和扩散能力要明显低于亲本母本毒株；在对小鼠的致病性实验中发现，无论是以后肢肌肉注射方式还是脑内注射方式进行感染， K1685A 和 K1829A 重组病毒都不能致使成年小鼠发病，而对乳鼠的致病性也显著低于母亲本毒株。K1685A 和 K1829A重组病毒感染RAW264.7 细胞后不能诱导更多的IFN-I，但对IFN-I敏感性显著增加。进一步研究表明K1685A 和 K1829A重组病毒对干扰素刺激因子IFIT2的表达更为敏感。小鼠免疫实验表明，与母本病毒相比，K1685A 和 K1829A重组病毒可以诱导相当的中和抗体，提供相近的免疫保护率。该研究对进一步理解狂犬病毒的致病性和逃逸宿主天然免疫的作用机制奠定了基础，同时也为狂犬病毒新型疫苗的研发和抗病毒药物靶点的筛选提供了新思路。