棘孢木霉的刺激植物响应蛋白Epl1诱导杨树系统抗病性机制

刺激植物响应蛋白（Epl1）是刺激植物生长并提高其免疫力的小分子蛋白。我们克隆了生防菌棘孢木霉（Trichoderma asperellum）的Epl1基因，发现其能响应病原菌诱导，表明其参与了木霉菌诱导植物抗病过程。在此基础上，拟克隆其启动子，研究其表达调控。并研究棘孢木霉与杨树互作，与杨树烂皮病和叶枯病菌互作，以及不同的N与C源培养条件下Epl1的表达，确定诱导Epl1的最佳条件；分别进行Epl1重组蛋白的原核（Epl1-E）及毕赤酵母（Epl1-P）表达，分离纯化Epl1-E和Epl1-P及其天然蛋白（Epl1-N）。将这三种蛋白及棘孢木霉孢子分别与杨树互作，用表达谱芯片研究互作后杨树免疫力提高的机制。研究互作前后信号传递分子茉莉酸、水杨酸等的变化；对三种蛋白诱导后的杨树接种病原菌，研究其抗病指数。为Epl1诱导林木提高免疫能力提供理论指导，并为相关生物农药的研制提供技术支持。

刺激植物响应蛋白（Epl1）是生防木霉菌刺激植物生长并提高其免疫力的小分子蛋白。棘孢木霉Epl1基因在MM、C饥饿、1%山新杨组培苗根粉等6种诱导条件下，均表现为上调表达。将Epl1基因启动子序列替换pYES2载体上的Pgal启动子，转化酿酒酵母GFP绿色荧光检测发现700bp的启动子区包含了Epl1基因转录调控的所有原件。.构建了重组原核表达载体pGEX-Epl1及大肠杆菌重组菌株BL21-Epl1，成功诱导表达并纯化出重组蛋白Epl1-E，SDS-PAGE检测，在40.37kDa处可见融合蛋白。确定了BL21-Epl1的最佳发酵条件和发酵生产工艺。30L小试发酵罐能发酵20 L发酵液4 h能产生Epl1-E蛋白约15 g。经Epl1-E诱导的山新杨平均增长量为对照的27.7%；POD、CAT、PPO和PAL分别在5d、12h、5d和5d增长量最大；生长激素、水杨酸、茉莉酸途径的相关基因均有明显的转录水平变化。.构建重组真核表达载体pPIC9K-Epl1及重组酵母菌株GS115-Epl1，诱导表达了重组蛋白Epl1-P，电泳检测可见14.37kDa分泌蛋白。同时确定GS115-Epl1的最佳发酵条件和发酵生产工艺。30L小试发酵罐能发酵20L发酵液6h能产生Epl1-P蛋白约24 g。经Epl1-P诱导的山新杨平均生长量为对照的25%；POD、CAT、SOD和PPO分别在12h、5d、3d和3d增长量最大；生长激素、水杨酸、茉莉酸途径的相关基因均有明显的转录水平变化。.研究了Epl1-P蛋白诱导山新杨后，山新杨抗病及防卫基因随时间的变化情况。山新杨5大类抗病基因，编码含LRR和NBS的胞质内受体相关蛋白；编码STK；编码具有胞质外LRR区域的跨膜受体蛋白；编码具胞外LRR区域和胞内STK的跨膜受体蛋白；编码毒素还原酶，均响应了Epl1的诱导。以及防卫反应相关基因：病程相关蛋白基因；水解酶基因；硫素基因；HRGP积累过程中的基因及调控，均发生了不同程度的上调和下调表达，证明Epl1能够全面激发山新杨的SAR和ISR。.总之，棘孢木霉ACCC30536菌株的Epl1可以诱导木本植物杨树防御反应达到多种病原菌的广谱抗病性，同时能够促进木本植物杨树的生长。