海洋源棘孢木霉漆酶基因家族铜离子调控网络研究

Fungal laccases are multi-copper phenol oxidases, which have important application value for biosynthesis, food processing, biological testing, the paper industry and degradation of environmental toxic compounds. Now, the biggest challenge is how to improve the supply of laccase. In this study, a Trichoderma strain was screened from the ocean, which showed the high laccase activity. We are studying on the molecular mechanism through comparative genomics at the genetic level. Furthermore, we will conduct functional cloning of the laccase-related genes by bioinformatics and molecular biology techniques. And then screen for the interacting proteins or transcription factors by pull-down. On the base of summarizing the previous research results of copper homeostasis network, we will further elaborate how the copper ions regulate laccase genes expression and transports into the target proteins. The results will help in revealing the molecular mechanism of the differences in laccase genes expression, which provide the theoretical basis for establishing a laccase expression system by Trichoderma and solute the resource shortages of laccase.

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在生物合成、食品加工、生物检测、造纸工业及环境有毒化合物降解等领域有着重要的应用价值。目前最大的难题是如何提高漆酶的供应。本研究已从海洋中筛选获得一株高漆酶活性的木霉菌株，正在通过比较基因组学，从基因组水平研究高漆酶活性机理。将进一步通过生物信息学分析及基因分子操作技术，克隆漆酶相关功能基因；以这些基因为靶标，通过蛋白互作及免疫共沉淀技术，筛选与之互作的蛋白或调控因子。结合申请者前期对于木霉菌胞内铜内稳态调控网络的研究成果，深入阐述铜离子如何调控漆酶基因表达以及铜离子如何定向转运至目标蛋白的信号传导途径。研究结果将有助于从分子水平揭示漆酶在不同真菌种属间表达差异的机理，从而为建立木霉菌高效表达漆酶体系，通过生物发酵途径解决漆酶资源短缺问题提供理论依据。

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在生物合成、食品加工、生物检测、造纸工业及环境有毒化合物降解等领域有着重要的应用价值。目前最大的难题是如何提高漆酶的供应。本项目筛选获得一株高漆酶活性的木霉菌株Ts93，该菌株同时对铜有明显的耐受能力；通过培养基及培养条件优化，漆酶活性提高了21倍。测定了Ts93全基因组序列，并且通过RNA-sequence分析了铜胁迫下菌株差异表达基因。生物信息学分析数据，筛选获得基因相关基因7个，铜相关基因33个。成功构建6个漆酶相关基因敲除载体，13个铜相关基因敲除载体，2漆酶相关基因过表达载体，2个漆酶相关基因荧光标记载体，5个铜相关基因过表达载体；成功获得2个漆酶基因的敲除及过表达突变株；8个铜相关基因的敲除突变株。通过分析漆酶相关基因的功能发现，基因敲除后，漆酶的活性有明显降低；替换强启动子后，漆酶的活性有明显提高。漆酶基因原核表达后，蛋白无漆酶活性，说明漆酶蛋白的后期糖基化对活性非常重要。研究结果将有助于从分子水平揭示漆酶在不同真菌种属间表达差异的机理，从而为建立木霉菌高效表达漆酶体系，通过生物发酵途径解决漆酶资源短缺问题提供理论依据。后期将继续分析其它5个漆酶相关基因与漆酶活性关系，同时，构建过表达突变株，提高漆酶产量；优化漆酶发酵条件，纯化漆酶蛋白，研究漆酶固定化方法，探索漆酶生物传感器在环境中烃类污染物检测中的应用。研究成果将为环境检测，食品检测及环境污染物的原位修复提供理论支撑。