基于TRPV1/TRPM8/TRPA1寒热敏感通道研究和胃降逆方通过寒热并调治疗食管内脏高敏感性NERD的作用机制

The abnormality of the temperature-sensitive channel centered on TRPV1/TRPM8/TRPA1 can stimulate esophageal visceral hypersensitivity, leading to non-erosive gastro-esophageal reflux. Previous studies have shown that HeWeiJiangNi Fang can reduce the hypersensitivity of esophageal viscera by regulating the 5-HT receptors related to the activation of TRPs to achieve the purpose of treating NERD, but its specific mechanism of action is still unclear. Therefore, we proposed the hypothesis that " Through the core of the temperature-sensitive channels—TRPV1 / TRPM8 / TRPA1 ， HeWeiJiangNi Fang could reverse the cold and heat to treat visceral hypersensitivity gastro-esophageal reflux". We will replicate the rat OVA-sensitized combined acid-perfused NERD model, and extract DRG cells to transfect with an activator of TRPV1/TRPM8/TRPA1 to prepare a TRPs pathway-overexpressing cell model. We will explore the role of HeWeiJiangNi Fang to TRPs activation and its mediation of Ca2+ influx by the comprehensive use of advanced techniques such as whole-cell patch clamp and calcium ion fluorescence probe from both in virto and vivo, in order to further explore the role of HeWeiJiangNi Fang in the treatment of esophageal visceral hypersensitivity NERD from the perspective of ion mobility between DRG cells.

以TRPV1/TRPM8/TRPA1为核心的寒热敏感通道的异常，能够激起食管内脏高敏感从而导致非糜烂性胃食管反流病（NERD）的发生。前期研究表明，和胃降逆方可通过调控与TRPs激活状态相关的5-HT受体来降低大鼠食管内脏高敏感性而达到治疗NERD的目的，但其具体作用机制尚不清楚。据此我们提出“和胃降逆方通过寒热并调， 调控以TRPV1/TRPM8/TRPA1为核心的寒热敏感通道达到治疗内脏高敏的NERD”的假说。因此我们拟通过复制大鼠OVA致敏联合酸灌注的NERD模型,提取DRG细胞并转染TRPV1/TRPM8/TRPA1的激活剂，制备TRPs通路过表达的细胞模型，从在体和离体两个方面，综合运用全细胞膜片钳和钙离子荧光探针等先进技术，观察和胃降逆方对寒热敏感的TRPs激活状态及其介导的Ca2+内流情况的影响，以期从细胞间离子流动的角度，揭示和胃降逆方治疗食管内脏高敏性NERD的分子机制。

非糜烂胃食管反流病（NERD）的发病率占胃食管反流病 (GERD)的70%，且其发病率呈逐年上升趋势，已经成为消化系统疾病研究中的热点与难点之一。目前 NERD 的治疗常以质子泵抑制剂（PPIs）作为首选药，但仅能治愈约 50% NERD患者。且长时间应用 PPI，易出现并发症，停药后有复发风险。而和胃降逆方对NERD的治疗整体上不劣于西药组，且副作用较小。本研究拟从在体和离体实验两部分，明确和胃降逆方对 TRPV1/TRPM8激活状态下 Ca2+内流及相关活性物质 SP、CGRP 的调节作用，并揭示和胃降逆方寒热敏感TRP通道治疗 NERD 的上游潜在作用机制。.本研究沿用申请人团队前期建立大鼠OVA致敏+酸灌注的NERD内脏高敏感性动物模型，在此基础上同时制备了应激束缚联合果糖喂养的NERD小鼠内脏高敏模型，运用Transwell小室共培养P815肥大细胞与原代背根神经元细胞，通过构建STIM1 siRNA干扰和过表达质粒转染细胞，并予和胃降逆方冻干粉干预；使用机械缩足反射阈值、热缩足反射潜伏期进行行为学观察，测量食管PH值，HE染色和透射电镜确定上皮细胞间隙值，甲苯胺蓝染色食管黏膜肥大细胞的脱颗粒数量；Western Blot、Real-time PCR 检测背根神经节及背根神经元细胞STIM1、TRPM8、TRPV1的mRNA及蛋白含量，Elisa及Real-time PCR检测食管黏膜和P815细胞中内脏高敏相关神经递质SP、CGRP的表达；采用荧光钙黄绿素粘附测定共培养细胞形态结构和黏附趋向变化；同时明确Ca2+浓度的表达变化。.通过研究我们发现应激束缚联合果糖喂养的NERD小鼠模型模型更符合NERD患者的内脏高敏表现。和胃降逆方作为寒热平调的代表药物，可以明显抑制 NERD食管粘膜上皮细胞间隙扩大，减少了线粒体损伤和肥大细胞脱粒，同时减轻了机械异常性疼痛和热神经病理性感觉并增加食管 pH 值。和胃降逆方抑制食管黏膜内脏过敏相关胃肠道神经炎性介质SP、CGRP的表达和肥大细胞脱颗粒活化，抑制背根神经节和背根神经元细胞STIM1、TRPV1及相关神经炎性介质的表达。STIM1 siRNA 和和胃降逆方均降低了 P815 细胞对背根神经元细胞的粘附和 Ca2+流入背根神经元细胞质空间，且和胃降逆方可以逆转 STIM1过表达诱导的TRPV1。