肝郁脾虚证大鼠模型CD4+T细胞平衡失调、结肠基因表达谱及逍遥散干预机制研究

Liver depression and Spleen deficiency is a common TCM syndrome that could be treated by the classical prescription of Xiaoyao San. In our previous researches, we have found that the immune function of CD4+T cell subsets including Th1、Th2、Th17、Treg、Th22 were dysequilibrium in Liver depression and Spleen deficiency model rats and their colon tissue existed differential gene expression. In the present study, we made the mode of Liver depression and Spleen deficiency rats by using separated living and chronic immobilization stress. To investigate the correlation between Liver depression and Spleen deficiency syndrome and the unbalanced immune function of CD4+T cell subsets, we use techniques of ELISA, flow cytometry, Real - time qPCR, Western blot to observe the expression of Th1、Th2、Th17、Treg and Th22 type cytokines and specific transcription factor.Further more, we will evaluate the treatment efficacy of Xiaoyao San for Liver depression and Spleen deficiency syndrome.To reveal the biological basis of Liver depression and Spleen deficiency syndrome from genomics level and find the mechanism and target of Xiaoyao San, we use gene chip to screen gene expression profile of the colon tissue and analyze it by the bioinformatics.It may provide a scientific experimental evidence for the guidance of clinical treatment and richment of the connotation of the Liver-Zang-Xiang Theroy.

肝郁脾虚证是临床上常见的中医证型，逍遥散是治疗肝郁脾虚证的经典名方。申请者前期的研究发现肝郁脾虚证大鼠存在Th1、Th2、Th17、Treg、Th22 等CD4+T细胞亚群免疫平衡失调和结肠组织差异基因组学背景。在前期研究基础上，本研究采用孤养加慢性束缚应激方法制作肝郁脾虚证大鼠模型，运用ELISA、流式细胞、Real-time qPCR、Western blot等技术方法，动态观察应激大鼠Th1、Th2、Th17、Treg以及Th22细胞各亚群特征性的细胞因子和特异性转录因子的表达情况，明确CD4+T细胞各亚群免疫平衡失调与肝郁脾虚证的相关性及逍遥散的调节作用；利用基因芯片筛选应激大鼠结肠组织差异基因表达谱并对差异基因表达谱进行生物信息学分析，从基因组学层面揭示肝郁脾虚证的生物学基础及逍遥散的作用机制。为指导临床治疗及丰富中医肝藏象学说的内涵提供科学的实验依据。

证候生物学基础及中药复方药效作用机制的发现和阐明，是中医理论现代化研究的主要领域。肝郁脾虚证是临床上常见的中医证型，其病理机制与脑-肠轴功能紊乱密切相关，逍遥散是治疗肝郁脾虚证的经典名方。 课题组前期的研究发现肝郁脾虚证大鼠存在多脏器差异基因组学背景和CD4+T辅助细胞（Th）亚群免疫漂移现象。本研究采用慢性束缚应激方法制作肝郁脾虚证大鼠模型并用逍遥散进行干预，应用基因表达谱芯片筛选大鼠结肠组织差异基因表达谱并进行生物信息学分析，同时运用ELISA、流式细胞、Real-time qPCR、Western blot等技术方法，动态观察肝郁脾虚证大鼠Th1、Th2、Th17、Treg以及Th22细胞各亚群的特征性细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-2、IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β、IL-22和特异性转录因子T-bet、GATA-3、Foxp3、RORγt、AhR的表达情况以及大鼠外周血、脾脏单核细胞中CD4+T细胞数目及CD4+ IFN-γ+、CD4+ IL-4+、CD4+CD25+ Foxp3+、CD4+ IL-17+、CD4+ IL-22+细胞占CD4+T细胞的比例。研究结果显示：①肝郁脾虚证大鼠结肠组织存在众多差异表达基因，这些差异表达基因参与了多条生物过程和信号通路的功能显著改变以及存在复杂的基因调控网络，涉及神经内分泌免疫系统等多系统功能的变化，多种在中枢表达的神经肽如5-HT、CRF以及多巴胺系统在结肠组织均出现了变化；逍遥散对肝郁脾虚证大鼠结肠组织显著改变的差异基因、生物过程、信号通路及基因调控网络均有调节作用。实时荧光定量PCR验证的差异表达基因和基因芯片结果基本吻合，证实了基因芯片数据结果的可靠性。②肝郁脾虚证大鼠CD4+T细胞亚群Th1、Th2、Th17、Treg、Th22 细胞发生了免疫漂移，其中慢性束缚应激7天，应激大鼠Th1/Th2平衡向Th2偏移，应激21天Th1/Th2平衡向Th1偏移；Th17、Th22细胞水平在7、21天应激阶段均升高，而Treg细胞水平则降低，Th17/Treg平衡向Th17偏移。本次研究丰富了肝郁脾虚证的生物学基础，为指导临床治疗肝郁脾虚证及抗应激损伤提供了科学的实验依据。