米多霉素合成的生化途径与基因改造

米多霉素(即灭粉霉素)是一种具有强烈抑制植物白粉病活性的肽核苷类抗生素，在农业和园艺业上具有重要的应用价值。前期的工作克隆了与米多霉素生物合成起始相关的两个重要基因，通过体内体外实验揭示了它们的功能，并且实现了米多霉素生物合成基因簇的异源表达。本研究旨在通过生物信息学分析，基因敲除结合代谢产物分析，功能蛋白体外催化反应，以及同位素前体喂养实验，以阐明米多霉素合成的完整生化途径，揭示发生在这一具有特殊化学结构的抗生素生物合成途径中的特异性生化反应过程；通过引入外源基因的手段，将米多霉素的生产菌株改造成专一生产高活性衍生物的工程菌株。为提高米多霉素的产量以及改造其结构提供分子基础和应用基础。

米多霉素（mildiomycin）是一种由生裂链轮丝菌（Streptoverticillum rimofaciens）产生的能够强烈抑制植物白粉病的肽核苷类抗生素。本课题在克隆了米多霉素生物合成基因簇的基础上，在变铅青链霉菌1326中异源表达了米多霉素；通过基因敲除结合产物的HPLC-MS鉴定的方法确定了基因簇的边界，将其限定在16个开放阅读框中。对于一个可能的糖基转移酶MilC进行了基因敲除，并在大肠杆菌中表达了具有活性的蛋白，体外酶活催化实验证实了MilC的胞嘧啶葡萄糖醛酸合成酶的糖基转移功能，并且对胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶都具有活性，这个米多霉素产物中的两个组分相吻合；序列分析MilG显示其含有CXXXCXXC的motif，为Radical SAM家族蛋白的典型特征，基因敲除milG导致了在发酵液中羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸的大量累积。C13标记的精氨酸喂养实验表明其完整的6个碳原子掺入了米多霉素的生物合成，吡喃糖上在C5位上发生了脱羧反应，精氨酸的C2与其形成C-C键；同时，外源的C13标记的4-羟基-L-精氨酸不能参与米多霉素的生物合成表明米多霉素生物合成过程中精氨酸残基的羟化发生在精氨酸骨架合成之后。通过系统的基因敲除实验并结合杀稻瘟菌素的生物合成基因簇的比较研究，得到了较为完整的米多霉素生物合成途径：胞嘧啶核苷单磷酸在MilA的作用下发生胞嘧啶C5位上的羟甲基化，然后水解酶MilB作用形成胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶，糖基转移酶MilC作用于UDP-葡萄糖醛酸与胞嘧啶或羟甲基胞嘧啶，形成（羟甲基）胞嘧啶葡萄糖醛酸，在MilG作用下脱羧，并和L-精氨酸结合，经过一系列后修饰反应，最后和丝氨酸合成出最终产物-米多霉素。