灰绿霉素（griseoviridin）和绿灰霉素（viridogrisein）的生物合成机制及其结构改造

灰绿霉素（griseoviridin）和绿灰霉素（viridogrisein）是由灰绿链霉菌Streptomyces griseoviridis生产的一对抗生素，分别属于聚酮聚肽类大环内酯和环脂肽类化合物，其结构复杂新颖，二者联合应用产生很强的协同抗菌活性，有关其生物合成机制和结构改造方面的研究，还未开展。本项目拟综合运用微生物学、天然产物化学、分子生物学、生物化学和药理学等多门学科专业技能，对灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成机制进行精细研究，获取二者完整的生物合成基因簇，发掘其生物合成基因簇中与众不同的功能模块或新功能基因，利用组合生物合成技术对生物合成基因簇进行阻断、置换、重组或异源表达，产生生物合成中间体或结构类似物，并利用体外蛋白表达技术，对一些在其生物合成过程中起关键作用或新功能酶进行体外生化表征，阐明两种抗生素及其各结构单元的生物合成机制，为新药研究与开发提供化学实体和物质基础。

灰绿霉素（griseoviridin）和绿灰霉素（viridogrisein）是一组具有显著协同抑菌能力的链阳菌素（streptogramin），相关的生产菌株广泛分布于陆生与海洋环境当中。本项目基于对灰绿-绿灰霉素生产菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427进行高通量全基因组扫描和基因组文库构建获得菌株遗传信息的基础上，首次鉴定分析了灰绿霉素和绿灰霉素长约105 kb的生物合成基因簇，并注释了全部36个开放阅读框（open reading frame ORF）。构建了基于PCR-Targeting的接合转移基因失活和回补遗传操作体系，获得了39个基因失活突变菌株和4个反式回补菌株，并分离获得3个代谢中间体。结合获得的基因失活菌株表型，依据生物信息学分析推导了灰绿霉素和绿灰霉素骨架组装模型，推导了γ-丁内酯类活性化合物的生物合成机制和相关的灰绿-绿灰霉素协同生产调控机制。证明了P450类单氧化酶SgvP是催化β位C-S键形成的关键蛋白；SgvG和SgvM参与催化导入β-甲基于L-亮氨酸并最终合成绿灰霉素；系统研究了SgvS和SgvD1在3-羟基吡啶甲酸的生物合成与组装中的作用。发现SgvT1和SgvT2是灰绿霉素和绿灰霉素生物合成中的关键分泌转运的蛋白，并分析其转运机制。本项目研究过程中在国际知名化学生物学杂志ChemBioChem上发表两篇亮点论文，其中一篇选为内封面文章发表，另一篇被Faculty 1000推荐评论；申请两项专利，其中一项已授权；在国内核心期刊上发表论文1篇；另有2篇高水平论文待发表。综上所述，本课题研究首次鉴定分析了灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇和相关功能基因，基于生物信息学分析推导相应的生物合成机制和揭示相关的调控和抗性机理，已有的研究结果为后续的深入研究探讨打下扎实基础也为链阳菌素和其他次级代谢产物的研究提供了良好的借鉴和参考。