丛枝菌根真菌Glomus mosseae Gm201基因在共生早期信号转导中的生物学功能研究

The arbuscular mycorrhizal(AM)symbiosis is the association between fungi and the roots of terrestrial plants . AM fungi are associated with 80% of terrestrial plants.Yet，molecular mechanisms leading to signaling events and appressorium formation are just beginning to be unravelled. In this study, gene Gm201 was selected from SSH library in vitro system of Glomus mosseae and Petroselinum crispum. The full length cDNA sequences of Gm201 was obtained. In view of the above, we are going to carry out the research on investigating the role of gene Gm201 in the molecular responses during early signal transduction .The expression of Gm201 is analyzed by real-time PCR; proteins interaction was studied by yeast two-hybrid; host induced gene silence and mutant yeast strains was used to study the functions of Gm201.This study will privide a better understanding of the signaling mechanisms involved in the endosymbioes,and also open the way to study the molecular mechanasims leading to its formation.

菌根是土壤真菌与植物形成的共生体，大约有80%的陆生植物能够形成菌根。丛枝菌根是最古老的 （距今已有4亿年）的真菌-植物共生体。菌根的形成是一个非常复杂的微生物植物相互作用过程，关于其共生关系建立的分子机制的研究已经成为该研究领域最活跃的热点问题。本项目拟在研究共生体形成早期共生双方在分子水平上的相互作用以及摩西球囊霉和荷兰芹共生早期的抑制差减杂交文库中Gm201基因的基础上，利用realtime-PCR研究基因的表达调控；利用酵母双杂研究蛋白质体内外相互作用以及利用宿主诱导的基因沉默和酵母突变株的功能互补进行基因功能验证。研究该基因在共生早期信号转导方面的调控机制，为AM真菌与宿主植物早期共生关系的建立提供新的分子生物学证据，进一步阐明AM真菌与植物共生体形成时相互识别的信号传导过程。

本课题以丛枝菌根真菌Gm201（Fm201）基因为主要研究对象，通过对已发表的Glumos mosseae (Funneliformis mosseae) BEG12类14-3-3EST标签Gm201进行3`RACE、5`RACE、反向PCR等分子技术获得Gm201的3`UTR、5`UTR以及启动子上游序列，并首次在菌根真菌中发现启动区内含子（或被称为选择性剪接外显子）以及同一基因的不同加尾现象的存在。通过酵母异源验证系统证明了Gm201蛋白为14-3-3蛋白家族成员。通过酵母单杂证明Gm201 启动子中含有STRE和pheromone-responsive element顺式作用元件可以被转录因子RiMsn2和GintSTE识别参与植物的非生物胁迫调控和菌丝的生长。通过启动子阶段实验在证明了Gm201 5`UTR intron在转录过程中起着增强转录的作用； 以YGFP为报告基因在酵母系统中证明了Gm201-3`UTRs的调控属于转录后调控，在同等转录水平下3`UTRS更容易降解，但是3`UTRS的翻译效率要高于3`UTRL。利用qPCR技术探索Gm201L和Gm201在Glomus mosseae与苜蓿的共生建立不同时期转录量的变化，分析Gm201基因共生期间在受到不同非生物压力下转录量的变化趋势。发现Gm201及其不同转录本在菌根共生关系建立过程中都呈现明显的上升，且Gm201L的变化趋势更明显，实验结果说明Gm201对Glomus mosseae与苜蓿之间信号的相互识别、定向生长以及发生物理接触都发挥着十分重要的作用。通过宿主介导的基因沉默（HIGS），证实了菌根真菌对菌根共生关系的维持具有不可或缺的作用。此外，通过对菌根共生系统进行胁迫处理证明了Gm201基因在菌根中的表达具有组织特异性。.本研究为丛枝菌根真菌与植物共生关系建立过程中信号转到的分子机制提供了有效的实验方法和可靠的依据。