多重耐药肺炎克雷伯菌质粒基因组的分子进化机制

半个世纪以来，微生物的耐药性问题，一直是医药界要克服的一个热点和难点问题。本项目以500株临床来源的多重耐药肺炎克雷伯菌为基础，将传统的Sanger和新一代高通量测序技术（Solexa）相结合，首次在质粒基因组水平上研究多重耐药肺炎克雷伯菌质粒基因组所携带基因的结构和功能基因的差异，揭示质粒基因组的分子进化规律。同时，高通量、有效地挖掘500株多重耐药肺炎克雷伯菌质粒基因组编码的耐药基因及其基因亚型。通过系统的分子进化分析，揭示肺炎克雷伯菌耐药基因的分子进化和演变规律。本项目的成功开展将为研究微生物耐药性机理，开发快速、特异、敏感的耐药基因分子生物学检测提供技术支持。同时，高通量和大规模获得的肺炎克雷伯菌耐药基因（包括新的耐药基因及其基因亚型），可为我国医药单位的药物研发提供相关信息，为肺炎克雷伯菌的合理用药提供指导，对提高我国耐药性相关的基础研究和应用研究水平，具有重要的意义和应用前景。

质粒介导的耐药基因转移是一种重要的多重耐药传播机制。为了深入了解肺炎克雷伯菌质粒基因组织和抗菌性演变，我们首先将质粒pKF3-140基因组被测定出。比较进化分析发现pKF3-140与大肠杆菌质粒具有潜在的起源。同时发现pKF3-140含八种耐药基因。结合转移实验明确了pKF3-140上抗性基因活性。pKF3-140具有由mmuP和mmuM组成的操纵子。mmuM是催化甲硫氨酸生物合成的关键酶并在代谢过程中起重要作用，结合转移实验表明其具有高水平的亚硒酸钠耐药性。同时发现耐药基因与伤寒沙门氏菌质粒基因表现出高相似性，表明pKF3-140的基因可能具有不同质粒来源的水平基因转移。成果发表于Gene杂志。进一步综合高通量测序和比较进化分析，探索mmuM基因在细菌间的分布、传播及演变。首先，我们发现mmuM在各细菌属的分布频率明显不同。序列映射和PCR扩增显示mmuM主要分布在七种病原体基因组中。系统发生分析显示某些mmuM虽然来源于不同属，但比同属间具有更高的亲缘关系。mmuM编码区的比较基因组分析表明pKF3-140和pIP1206质粒共享一个同源区域，该区域起源于大肠杆菌，表明mmuM也经历了属间的水平基因转移。成果发表在IJBS上。同时，我们使用高通量测序，在大型多药耐药质粒集合中研究耐药基因的分布，突变和进化。前期分离到多株肠杆菌科临床株，包含大肠杆菌，肺炎克雷伯菌等。对提取的质粒进行测序，鉴定32个耐药基因，丰度最高的为blaTEM。通过比对，我们发现β-内酰胺类和氨基糖苷类抗性基因是最普遍的。多态性分析在抗性基因中鉴定到多个SNP突变。此外，在质粒上还鉴定到两个新的blaKLUC基因，实验表明blaKLUC-3具有广谱β-内酰胺类抗生素抗性。blaKLUC-4不表现耐药性，推测是由于其167位氨基酸突变引起。成果发表于Plos One上。我们构建了Exome-assistant工具，可用来根据高通量测序检测SNP突变并对突变位点进行功能注释，便于研究人员提交他们的测序和突变信息，找到重要突变位点和研究突变在样本间的发展和进化。该工具将被不断更新并适用于不同物种数据的分析需求。同时，我们利用高通量测序技术进行转录组相关技术的研究为在微生物水平对致病菌的转录机制研究铺垫基础，从转录表达水平研究耐药机理。成果发表在Cancer Letter及BMC genomics。