死亡相关蛋白激酶DAPK的亚硝基化在缺血性脑损伤中的作用

在缺血性脑中风中，死亡相关蛋白激酶DAPK的活性与海马神经元的凋亡关系密切，被认为是治疗缺血性脑损伤的可能靶点。在脑缺血中，DAPK可通过NMDA受体的Ca2+ 内流激活钙调神经磷酸酶去磷酸化而被激活，进而磷酸化下游底物引起细胞凋亡，但目前对DAPK的下游信号通路的研究还较少。我们的前期研究发现在大鼠脑缺血再灌注过程中，DAPK磷酸化降低的同时巯基亚硝基化显著增强，这说明DAPK的活性调节受到巯基亚硝基化和磷酸化的共同调节。本项目以全脑缺血和OGD等模型，拟通过生物化学和分子生物学方法研究DAPK的亚硝基化位点和脑缺血过程中DAPK亚硝基化的变化与调节机制，主要研究内源性一氧化氮合酶nNOS和外源性NO供体对DAPK亚硝基化的调节；同时，研究DAPK亚硝基化对下游caspase凋亡途径的激活和神经元凋亡的作用，从而阐明巯基亚硝基化在DAPK活性调节中的作用，为治疗缺血性脑损伤提供新的对策。

本项目研究采用分子生物学（基因克隆、点突变和转染）、生化技术（免疫沉淀和免疫印迹）以及免疫组化和组织学技术等方法，在全脑缺血模型、缺糖缺氧（OGD）细胞模型上研究了死亡相关蛋白激酶（DAPK）巯基亚硝基化在缺血性脑中风的作用。本项目研究按计划进行，顺利完成主要研究内容并有所拓展。结果显示：（1）鉴定DAPK巯基亚硝基化位点的半胱氨酸可能是第305位半胱氨酸；（2）脑缺血再灌注过程中内源性一氧化氮（NO）促进DAPK巯基亚硝基化，抑制内源性一氧化氮合酶nNOS可以抑制DAPK的巯基亚硝基化、增强DAPK磷酸化水平；（3）外源性NO可以抑制DAPK的巯基亚硝基化、增强DAPK磷酸化水平；（4）格尔德霉素可以降低DAPK的表达水平、抑制caspase-8的活化水平；（5）通过调节DAPK的表达水平、亚硝基化和磷酸化化学修饰水平可以调节DAPK活性，抑制神经元凋亡。结果提示:DAPK活性调节在脑缺血引起神经元损伤中起重要作用，调节DAPK亚硝基化和磷酸化修饰可能成为潜在的药物治疗脑中风靶点。