计算机辅助设计非天然硫醚共价键提高工业水解酶热稳定性的研究

The stability of enzymes in catalytic reactions is not only a guarantee for the realization of green chemistry, but also a bottleneck restricting their application. Directed evolution have greatly improved the efficiency of enzyme modification, however, still subject to high-throughput screening and time cost issues. Here, based on protein 3D structures, we use Rosetta-guided computational design to instal genetically encoded, nonreducible covalent staples in target proteins. This method enables dramatically enhanced thermostability without altering their catalytic efficiency. In addition, the stabilized variants offer the structural effect on the stabilization mechanism of α/β hydrolase. Computational design greatly reduce the library capacity for screening. In the meantime, the unnatural thioether covalent bond is more specific and more stable than natural disulfide bonds. This work should not only prepare enzymes that meet the requirements of harsh industrial applications, but also be applicable to a variety of other proteins, offering important scientific theories and application values.

酶在催化反应过程中的稳定性，是实现绿色化工的重要保障，也是制约酶制剂应用的重要瓶颈。定性进化技术大大提高了酶的工业改造效率，但是仍然受制于高通量筛选及时间成本等问题。本研究以不同种类的微生物水解酶为研究对象，基于3D晶体结构，利用Rosetta计算设计突变位点，引入可基因编码的非天然氨基酸与蛋白序列之间形成共价键，在兼顾酶的催化效率的同时，大幅度提高酶的稳定性，并通过研究不同种类α/β型水解酶之间的稳定性规律，探究水解酶结构对于稳定性影响的机制。以计算为基础的理性设计不仅可以大幅度降低筛选的库容量，而且非天然硫醚共价键比二硫键特异性更强、稳定性更高，本研究不仅可以改造适应苛刻工业应用要求的酶制剂，同时也为研究其他蛋白质的稳定性提供有益的借鉴，具有重要的科学理论与应用价值。

高效且具有鲁棒性的提高蛋白质稳定性的计算设计策略，是应对不同工业需求，实现绿色化工的重要保障。本课题建立了利用RosettaMatch引入非天然氨基酸共价键，结合RosettaDesign对可能造成空间冲突的位点进行突变设计以及序列保守性和共进化分析等的计算设计流程，并将此策略引入重组胶原蛋白的计算设计，可以有效地促进胶原蛋白交联，形成最大分子粒径可达1 μm以上的聚集体，促进了胶原蛋白水凝胶的形成，为重组材料蛋白的设计提供了新思路。并在此基础上对RosettaMatch脚本进行编译，开发了利用计算设计引入小分子装订与突变位点之间自发反应形成非天然氨基酸共价键，实现蛋白分子内的共价键装订的策略，在兼顾酶催化效率的同时，提高酶的稳定性。此外，开发了基于蛋白质空腔填充和蛋白溶剂可及表面积及序列保守性的多重计算设计策略，以及利用互补算法软件为正筛，序列保守性分析和共进化分析为负筛的策略，为天然酶的热稳定性改造提供了高效且兼顾用户友好性的计算设计策略。在项目执行期间，发表了学术论文3篇，其中SCI收录1篇；申请国家发明专利1项，已授权1项；培养了硕士研究生6名，其中2名已经取得硕士学位，在读硕士研究生4名。项目预算直接费用21.0000万元，支出18.5803万元，结余2.4197万元，剩余经费用于本项目研究后续支出。