小麦孢囊线虫致死基因筛选及RNAi作用机理研究

小麦禾谷孢囊线虫是我国小麦生产的重要病原线虫，严重威胁我国小麦的安全生产。本项目构建小麦禾谷孢囊线虫寄生前二龄幼虫和侵入后二龄幼虫cDNA文库，筛选致死基因；用高通量RNA体外原位杂交方法筛选寄生基因，在体外离体条件研究致死及寄生基因RNAi效果。创建小麦毛状根发根体系，用表达dsRNA的小麦毛状根作为活体测试系统，研究线虫致死靶基因的RNAi沉默效果和作用机理，明确表达dsRNA的小麦毛状根中siRNA的特性和线虫取食的最佳siRNA长度。研究构建的小麦毛状根dsRNA递送体系，使线虫取食后可导致基因沉默并最终死亡，达到利用RNAi技术来控制孢囊线虫危害的目的，为最终研发表达致死和寄生基因的dsRNA的抗孢囊线虫的小麦奠定基础，为开发小麦孢囊线虫新型控制技术提供支撑，对于采取科学合理的措施控制小麦禾谷孢囊线虫的爆发，保障粮食安全具有十分重要的理论价值和实际意义。

小麦禾谷孢囊线虫是我国小麦生产的重要病原线虫，严重威胁我国小麦的安全生产。在本项目的支持下，对小麦禾谷孢囊线虫寄生5个主要发育阶段（侵染前二龄幼虫，侵染后二龄幼虫、三龄和四龄幼虫、雌虫和卵））进行高通量测序和分析。分析结果表明，共组装出unigenes114202条，通过blast比对，获得473个和已报道的线虫效应蛋白同源的序列，筛选获得466个潜在的效应蛋白和71个具有胚胎致死或者幼虫致死的RNA致死基因，在此次基础上对其中的3个效应蛋白和5个致死基因进行了体外RNAi干扰，结果表明，其中一个钙网蛋白RNAi干扰后，繁殖率下降70.94%，3个幼虫致死的RNAi致死基因RNAi后，雌虫数分别下降36.75%、69.23%和65.81%。构建用了研究小麦孢囊线虫基因功能的BSMV-VIGS平台，完成了7个候选效应蛋白的功能研究。在上述基础上，从小麦禾谷孢囊线虫中克隆出1个酸性磷酸酶基因的致病因子和2个内切葡聚糖酶基因，并采用RNAi对其功能进行的分析，酸性磷酸酶基因RNAi沉默后的线虫对寄主植物的侵染能力下降50%， 内切葡聚糖酶基因dsRNA浸泡处理后的小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫的侵染率下降了40.1%。从而明确了上述3个效应蛋白在线虫寄生过程中发挥着重要作用。开展了小麦禾谷孢囊线虫引起或抑制过敏性细胞死亡的效应蛋白的筛选和功能分析，从中获得一个CRT10可以抑制Bax引起的细胞凋亡的效应蛋白，一个CD16可以在烟草叶片引起细胞凋亡的效应蛋白，并对其功能进行了进一步的研究。从而圆满完成了本项目的研究任务。上述研究结果将对于采取科学合理的措施控制小麦禾谷孢囊线虫的爆发，保障粮食安全具有十分重要的理论价值和实际意义。