植物金属硫蛋白聚合性质研究及稀土离子与聚合相关性分析

The biological function of metallothionein is relative to trace elements metabolism, removing toxic heavy metals and scavenging free radicals in organisms. Moreover, it also could influence the growth and development, reproduction, caducity, tumorigenesis, immunity, stress and so on.The important form of protein is polymerization when it plays physiological function.Polymerization is closely related to the redox state and the concentration of the metal ions of the cells. Compared to the a widely reseached animal metallothionein, the study on plant metallothionein is still in its infancy. In this work, the polymerization mechanism of plant (corn) metallothionein, the influence factors of polymerization, the main polymerization form of the protein, the main acting force in the process of polymerization, the key structural domain of polymerization, and the molecular mechanism of polymerization will be researched thoroughly by dynamic light scattering,SDS PAGE, MALDI-TOF-MS and so on.Besides, the relavance of lanthanide ions to the plant metallothionein will be clarified by considering the influence of lanthanide ions on the plant metallothionein polymerization.Consequently, the results will provide the direct evidence to the clarification of the biological effect of lanthanide ions.

金属硫蛋白的生物学功能涉及生物体微量元素代谢、解除重金属的毒性、清除自由基以及机体生长、发育、生殖、衰老、肿瘤发生、免疫、应激等各个方面。蛋白的聚合行为作为其发挥生理功能的重要表现形式与细胞的氧化还原状态及胞内金属离子浓度的调控密切相关，相对于研究较为广泛和成熟的动物金属硫蛋白来说，植物金属硫蛋白功能的研究尚处于起步阶段，本申请将以其聚合性质的研究作为突破口，拟用基因工程的方法构建植物（玉米）金属硫蛋白的原核表达载体，通过分子生物学方法分离、表达、纯化得到玉米金属硫蛋白，通过动态光散射，凝胶电泳，蛋白质质谱等多种方法研究植物金属硫蛋白的聚合性质，影响聚合的主要因素，蛋白的主要聚合形式，聚合过程的主导作用力，控制聚合的关键性结构域，阐明聚合作用的分子机制，并通过研究稀土离子对蛋白聚合的影响，明确稀土发挥植物生理效应与植物金属硫蛋白之间的关系，为稀土生物效应的阐明提供直接的证据。

金属硫蛋白（metallothionein, MT）是一种低分子量、半胱氨酸含量丰富、可结合d10过渡金属的特异性蛋白质，广泛存在于各种动、植物以及微生物体内。相对于研究较为广泛和成熟的动物金属硫蛋白来说，对植物金属硫蛋白的功能研究尚处于起步阶段。本项目首先采用基因工程的方法构建含有玉米金属硫蛋白基因的重组表达质粒pGEX-6p-1-MT1，通过分子生物学方法分离、表达、纯化，首次在体外获得了大量高纯度的玉米金属硫蛋白，并通过凝胶电泳，蛋白质谱等多种手段进行表征。在此基础上通过紫外吸收光谱研究玉米金属硫蛋白结合不同重金属离子以及改变溶液pH 值时的特征吸收光谱变化，最后探讨了金属离子、螯合剂、缓冲液类型对玉米金属硫蛋白氧化速率的影响。主要结论如下：（1）蛋白表达纯化的条件为将蛋白基因克隆至pGEX-6p-1载体上，5 mL LB培养基中Zn2+浓度为50 μM，1 mM IPTG，37℃在大肠杆菌细胞内表达，PPase柱上切割获得目的蛋白。（2）通过Cd2+/Zn2+/Pb2+滴定脱金属硫蛋白，观察不同金属硫醇簇LMCT吸收谱带的变化来探究金属离子与玉米MT的结合能力，得到玉米MT1对金属的亲和力符合Cd2+ > Pb2+> Zn2+，与玉米MT对金属-硫醇簇的半解离pH值分别为~4.0，~4.5与~5.2相吻合。玉米MT1的金属-硫醇簇pH稳定性与其他植物MT具有可比性。（3）生理元素Zn2+只在高浓度下产生抑制作用；而对MT具有更强亲和力的有毒重金属Cd2+在低浓度即对MT氧化产生明显的抑制作用。相比于其它螯合剂，EDTA表现出明显加快MT氧化速率的趋势。常用的缓冲溶液增强氧化反应活性的程度符合：HEPES < Tris-HCl < PBS。玉米MT与稀土离子结合初步实验表明蛋白与Lu3+的结合能力强于La3+。