miRNA介导RNA m6A修饰通过Wnt信号通路调控AML增殖和化疗敏感性的分子机制研究

N6-methylated-adenylate (m6A) modification is the most common methylation for RNA, however, its function is still unclear in acute myeloid leukemia (AML). In the previous experiment, we screened a new anti-cancer microRNA, miR-550-1, according to our microarrays in AML. Overexpression miR-550-1 could induce the m6A level, decrease the stability and expression level of Wnt-pathway gene, inhibit Wnt pathway activity, suppress proliferation and enhance chemosensitivity in AML. Through lentivirus and CRISPR/Cas9 system, we will detect the regulation mechanism of miR-550-1 on m6A modification in the further study. The relationship between miR-550-1, m6A and the prognosis of AML patients will be analyzed. And then in the miR-550-1 overexpression or knockdown cell model, we will confirm the mechanism how m6A block cell proliferation and enhanced chemosensitivity by regulating Wnt signal pathway. Finally, the mouse bone marrow transplantation model will be used to investigate the biological effect of miR-550-1 and m6A in vivo. This project has important theoretical and practical value for the precise treatment to AML by targeting miR-550-1 and m6A.

N6-甲基化-腺苷酸（m6A）修饰是RNA最常见的甲基化修饰，然而其在急性髓系白血病（AML）中的作用尚未明确。我们前期miRNAs芯片筛选出AML中新的抑癌miRNA，即miR-550-1。其过表达可诱导AML细胞m6A水平显著下调，降低Wnt通路相关基因mRNA稳定性及表达量，抑制Wnt通路活性，阻碍细胞增殖并增加其化疗敏感性。本项目拟通过慢病毒和CRISPR/Cas9系统分析AML中miR-550-1对m6A修饰的调控机制，运用临床大样本验证miR-550-1、m6A与患者预后的关系以及和靶基因间的相关性，然后在miR-550-1过表达和敲低的AML细胞模型中明确其介导m6A修饰调控Wnt通路阻碍细胞增殖和增强化疗敏感性的机理，最后利用小鼠骨髓移植模型探讨miR-550-1与m6A体内的生物学功能。本课题对AML靶向miR-550-1和m6A的精准治疗具有重要的理论意义与实际价值。

表观转录组学在AML的发生发展中具有重要调控作用，N6-甲基腺苷（m6A）是近年来表观遗传学领域的研究热点，然而其与miRNAs间相互调节在AML发病机制中的功能仍未明确。本课题在前期miRNAs芯片结果基础上发现AML中新的抑癌miRNA，即miR-550-1，并明确了其下游m6A修饰相关靶基因（WTAP），通过MTT、Western blot、Dot blot、流式细胞术、克隆形成、白血病骨髓移植小鼠模型等一系列实验方法，明确了其在AML发生发展中的新机制。我们的结果表明由于启动子区CpG岛的高度甲基化，miR-550-1在AML中显著下调。当过表达miR-550-1时，可诱导AML细胞G0/1期阻滞，促进分化和凋亡，从而在体内外阻碍AML细胞的增殖。分子机制研究中，我们发现WWTR1和WTAP是miR-550-1的下游靶点。miR-550-1通过靶向WTAP，抑制m6A水平，降低WWTR1的mRNA稳定性抑制其表达，而通过与WWTR1的3’UTR互补配对，抑制其蛋白表达，最终导致Hippo信号通路失活，阻碍疾病的发生发展。挽救实验结果表明，过表达WWTR1可逆转miR-550-1的抗白血病作用，而敲低WWTR1可模拟过表达miR-550-1的抑癌作用，进一步证实了WWTR1是miR-550-1发挥抑癌功能的直接靶点。我们的数据表明miR-550-1和WWTR1可以作为AML治疗的新靶点，为临床精准治疗提供新的理论依据。此外，我们发现高表达PARP是AML患者预后不良因素，PARP特异性抑制剂Talazoparib可协同苯达莫司汀化合物NL101诱导高水平细胞DNA损伤治疗AML。而利用一种新型的BTK抑制剂，Abivertinib，我们发现联合经典化疗药物高三尖杉酯碱，通过抑制PI3K和Stat信号通路的活性，下调p-FLT3的表达水平，可发挥良好的协同抗白血病功能。这两项研究的结果为探索AML新的治疗方案提供了有力依据。