WNT10A介导的WNT信号通路对人牙髓干细胞增殖分化的影响及其分子调控机制

牙齿发育是由许多基因、转录因子和信号传导分子参与的，目前对于造成牙齿发育异常的病因机制并不十分清楚。了解牙齿发育过程的关键，就是要深入研究控制牙源性上皮和间充质细胞增殖、分化的信号通路，以及信号通路之间的相互作用。本研究将前期实验中新发现的在单纯型先天缺牙患者中检测出的WNT10A基因突变为研究对象，根据该基因在牙齿发育过程中的时间-空间表达特点，构建人WNT10A基因的真核表达载体和突变质粒，转染免疫磁珠分离纯化的人牙髓干细胞，确定WNT10A在调节人牙髓干细胞增殖和向成牙本质细胞分化过程中的具体作用及其所调控的下游信号分子。进而分析WNT10A基因突变（cDNA135 C>T，cDNA 212 G>A）所造成的蛋白质功能影响，从而深入的地了解WNT10A基因及WNT信号通路在牙齿发育中的作用，为今后构建转基因小鼠模型进行体内功能研究奠定坚实的分子生物学基础。

牙齿发育是由许多基因、转录因子和信号传导分子参与的，目前对于造成牙齿发育异常的病因机制并不十分清楚。了解牙齿发育过程的关键，就是要深入研究控制牙源性上皮和间充质细胞增殖、分化的信号通路，以及信号通路之间的相互作用。本研究将前期实验中新发现的在单纯型先天缺牙患者中检测出的WNT10A基因突变为研究对象，根据该基因在牙齿发育过程中的时间-空间表达特点，构建人WNT10A基因过表达及沉默的慢病毒转染系统，转染免疫磁珠分离纯化的人牙髓干细胞。结果如下：.1.在对人牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞分别进行成脂诱导和成骨诱导一周后收集RNA和蛋白质，用qPCR和Western Blot检测样本中WNT10A mRNA和蛋白质的表达变化，发现在成骨过程中WNT10A的表达升高，而在成脂过程中WNT10A的表达降低。.2.构建了WNT10A过表达及沉默的慢病毒体系,并在人牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞中验证了效果可靠。.3.研究发现，在人牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞中，WNT10A可以促进成骨。在人牙髓干细胞或骨髓间充质干细胞中过表达或沉默WNT10A后成骨诱导，一周后收集蛋白，Western Blot检测成骨marker（ALP，Runx2和OCN）的变化，发现WNT10A过表达以后以上三种蛋白的表达升高，WNT10A沉默以后以上三种蛋白的表达降低。另外，过表达或沉默WNT10A后，成骨诱导四周，然后用茜素红染色，发现WNT10A过表达以后成骨能力增强；WNT10A沉默以后成骨能力降低。.4.研究发现，在牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞中，WNT10A可以抑制成脂。在人牙髓干细胞或骨髓间充质干细胞中过表达或沉默WNT10A后成脂诱导，一周后收集蛋白，Western Blot检测成脂marker（PPARγ2和LPL）的变化，发现WNT10A过表达以后以上两种蛋白降低，WNT10A沉默以后以上两种蛋白表达升高。另外过表达或沉默WNT10A成脂诱导四周，然后用油红染色，发现WNT10A过表达以后成脂能力降低；WNT10A沉默以后成脂能力增强。.5.研究发现，在人牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞中，WNT10A可以促进成牙本质向分化。在人牙髓干细胞成牙本质诱导过程中，过表达WNT10A可以使牙本质发育相关基因（DSPP，DMP-1和MEPE）的表达增高，而沉默WNT10A以后上述三个基因表达降低。