鱼类呼肠孤病毒拮抗干扰素系统的分子基础研究

Aquareovirus, members of the Reoviridae family, is known to induce interferon (IFN) antiviral response depending on viral genomic dsRNA. As mammalian orthoreoviruses, the aquareoviruses have evolved various mechanisms to subvert the IFN pathway. Our group have made some progress in genome sequencing and pathogenesis research of the aquareoviruses. The objective of this study is to investigate the mechanism underlying aquareoviruses antagonize the IFN response. The aquareovirus VP7 and VP4 protein are homologue of the mammalian orthoreovirus σ3 and μ2, respectively. The interactions between VP7 and PKR, as well as between VP4 and IRF9 will be assessed by using reverse genetic technology, gel shift, and co-immunoprecipitation assays. The IFN reporting system will be utilized to investigate whether the other viral proteins are involved in inhibition of IFN induction and action. The virus strain-specific differences in repression of the IFN response will be further determined. This study will provide a better understanding of aquareovirus-host interactions, and guidances for immunological control of diseases.

鱼类呼肠孤病毒的基因组双链RNA能激活宿主干扰素介导的抗病毒天然免疫，而病毒也发展了多种策略拮抗干扰素系统。本项目立足于课题组已开展的鱼类呼肠孤病毒基因组测序及致病机制研究基础，拟围绕病毒拮抗干扰素系统的分子基础开展研究。首先针对鱼类呼肠孤病毒编码的干扰素拮抗因子同源蛋白VP7和VP4，利用反向遗传学和蛋白-RNA、蛋白-蛋白互作技术，研究二者对干扰素系统基因PKR和IRF9的抑制作用。接着，利用报告基因系统和蛋白质组学技术，研究其余9个基因组节段编码的蛋白对干扰素抗病毒反应的作用及方式。最后，比较致病性不同的毒株抑制干扰素系统的差异，以期阐明鱼类呼肠孤病毒感染与宿主干扰素抗病毒免疫之间的关系，为抗病毒药物和新型疫苗研发提供靶点。

鱼类呼肠孤病毒的基因组双链RNA能激活宿主的天然免疫RLR信号通路，诱导干扰素产生及抗病毒基因表达，从而建立宿主细胞的抗病毒状态。但另一方面，病毒也通过编码蛋白拮抗干扰素的抗病毒作用，从而导致病毒的致病性增强，成为目前鱼类病毒病防控中的难题之一。因此，研究鱼类呼肠孤病毒拮抗宿主免疫系统的分子基础具有重要意义。. 本项目以严重危害水产养殖的草鱼呼肠孤病毒为研究对象，解析了病毒基因组编码的VP7、VP4及VP6蛋白对干扰素系统的拮抗作用。通过分析VP7蛋白的dsRNA结合活性、对PKR抑制翻译功能及其介导的抗病毒途径的影响，阐明VP7拮抗干扰素系统的机制；通过分析过表达和基因敲降VP4时，干扰素的诱导和病毒的复制情况，以及VP4对IRF9核聚集的影响，明确VP4拮抗干扰素系统的机制；鉴定其它参与拮抗干扰素系统的病毒基因，分析其作用靶标和机制。结果显示：草鱼呼肠孤病毒S10基因节段编码的VP7蛋白能结合人工合成的双链RNA(PolyI:C)，阻断抗病毒蛋白PKR介导的翻译抑制和细胞凋亡作用，从而抑制干扰素系统；S5基因节段编码的VP4蛋白能阻断干扰素启动子和干扰素刺激效应元件ISRE的激活。过表达VP4能抑制干扰素的抗病毒作用，导致病毒复制增加。相反，敲降VP4则不能拮抗干扰素的抗病毒作用，导致病毒复制减少。亚细胞定位结合基因敲降实验证实，VP4能诱导干扰素调控因子IRF9聚集，抑制转录因子复合体ISGF3形成，从而阻断干扰素信号通路；通过报告基因系统，鉴定其余9个病毒基因组节段中，S8节段编码的VP6蛋白能抑制干扰素系统。过表达VP6导致干扰素的抗病毒作用降低，病毒复制增加，而敲降VP6则相反。进一步研究VP6针对RLR信号通路的作用环节，发现VP6能抑制由IRF3介导的干扰素生成。VP6和IRF3在细胞中共定位，通过抑制IRF3的核转运而阻断其活化。结构域的缺失突变显示，N端和C端结构域是VP6发挥拮抗功能所必不可少的。研究结果表明，草鱼呼肠孤病毒通过VP7、VP4及VP6蛋白拮抗干扰素系统，逃逸宿主的免疫监控，为下一步研发抗病毒药物和新型疫苗研发提供了基因资源。