禽呼肠孤病毒感染诱导细胞自噬的分子机理研究

Avian reovirus (ARV) infection is an important cause of many poultry diseases. Our previous study showed that the ARV isolate strain GX/2010/1 induces autophagy in both Vero and primary chicken embryonic fibroblast (CEF) cells and autophagy may play a critical role in determining viral yield during ARV infection. The aim of this current study is to explore the molecular mechanism of ARV-induced autophagy. To assess the effects of ARV-encoded proteins on autophagy, the plasmids and Vero cell lines stably expression of viral structural protein σC and non-structural protein μNS will be constructed, then the distribution of viral protein in cell organelles during the autophagic vesicle formation and maturation will be observed. Lentiviral vector encoding siRNA of Beclin-1 and Atg 4B will be constructed and transducted Vero cells to manipulate the expression and function of key autophagy regulators, then the titer and gene expression level of ARV, the LC3-II production postinfection will be checked to demonstrate that autophagy is required for ARV replication. Futher, treatment of ARV-infected cells with the apoptosis inhibitors, autophagy inducer (rapamycin) and inhibitor (chloroquine) respectively will be performed to investigate the probable autophage pathways and the relationships between ARV-triggered autophagy and apoptosis.

禽呼肠孤病毒（ARV）感染可以引起多种禽类的重要疾病。本项目在前期发现ARV GX/2010/1感染致Vero细胞和鸡胚成纤维细胞自噬、证明PI3K/Akt/mTOR通路与细胞自噬有关的基础上，将进一步研究ARV诱导细胞自噬的分子机理，为防控ARV感染提供新依据。通过构建ARV σC蛋白和μNS蛋白的表达质粒和细胞系，观察病毒蛋白在细胞器内的分布和自噬的形成过程，明确ARV编码的蛋白质在诱导自噬中的作用。构建表达自噬蛋白Beclin-1和Atg 4B的siRNA慢病毒载体，通过RNA干扰技术调控自噬蛋白的表达，测定ARV不同感染阶段的病毒滴度和基因表达，检测感染细胞中LC3 II蛋白的聚集，阐明自噬蛋白与ARV病毒复制的关系。分别应用凋亡抑制剂、自噬诱导剂和自噬抑制剂处理ARV感染细胞，分析ARV感染细胞信号转导通路的活化程度，评价ARV感染诱导的细胞凋亡和自噬的关系。

本项目对禽呼肠孤病毒（ARV）结构蛋白σB、σC和非结构蛋白σNS、p10、p17进行研究，首次发现p17具有诱导细胞自噬的作用，而其他蛋白不具有该作用。通过鉴定p17 蛋白的核输入信号与核输出信号，并突变p17蛋白核输入信号相关的功能氨基酸位点后，探究了p17 蛋白的细胞定位对其诱导的细胞自噬的影响，以及对病毒复制的影响。p17蛋白可以通过PTEN、AMPK和PKR/eIF2α等途径诱导细胞发生自噬，p17诱导PTEN信号通路的上游蛋白是p53，对自噬调控的通路主要为p53-PTEN-mTOR。.本项目分别在细胞、鸡胚及SPF鸡水平上证明，不论在体内还是在体外，细胞自噬可以促进ARV的复制。自噬抑制剂可显著抑制ARV诱导的细胞凋亡，降低病毒复制水平；对鸡胚，可显著降低ARV导致的胚体死亡率；ARV感染1日龄 SPF鸡后能够在体内诱导自噬的发生，但这种自噬现象是短期的，且自噬水平与病毒的复制具有一定的时间依赖性；ARV能够利用机体的短期自噬使得病毒滴度得到短暂的升高；使用自噬抑制剂CQ能够导致组织器官细胞内LC3-Ⅱ蛋白的累积，并能使得病毒复制水平略有降低。本项目发现p17还可以对抗细胞天然免疫反应，间接促进ARV病毒复制；采用高通量测序技术对ARV感染细胞的转录组进行研究，发现ARV感染的干扰素耐受机制是病毒复制阻断了细胞自身的mRNA的翻译，继而阻断了干扰素通路末端效应基因的激活。.本项目的研究成果为ARV感染的防控提供了理论依据，对于阐明其他动物病毒性传染病的致病机理亦具有参考价值。