番鸭呼肠孤病毒致弱分子机理研究

The project will clarify the molecular mechanism of virulence attenuation of muscovy duck reovirus(MDRV) based on total gene sequence differences with MDRV virulence strain (MW9710 strain) and attenuated strain (CA strain). To explicit the relation S1 and S4 gene with virulence, we construct S1 and/or S4 gene hybrid recombinant plasmids that take MDRV MW9710 strain and CA strain as skeleton by the method of reverse genetics technology for dsRNA virus, and then the plasmids are transfected into 293T cells to rescue a virus to detect the biological character. To explicit the nucleotide acid accurate mutation site of virulent gene in MDRV, according to the difference of nucleotide acid in S1 and S4 gene of MDRV MW9710 strain and CA strain, we introduce the mutation into virulence gene to construct recombinant plasmid and to rescue a virus to detect the biological character. Above all, we hope to reveal the molecular pathogenic mechanism and clarify the molecular attenuation mechanism, enrich molecular information and research connotation, provide a platform for the function study of gene and encoded protein of MDRV,lay foundation for prevention and control with muscovy duck reovirusis.

本项目在明确番鸭呼肠孤病毒强毒株（MDRV MW9710株）和弱毒株(MDRV CA株)全基因序列差异的基础上，为了阐明MDRV致弱的分子机理，拟应用双链RNA病毒反向遗传学技术，以MDRV S1和S4片段为目的基因，分别构建以MDRV强、弱毒株为骨架的嵌合体重组质粒，转染细胞获得拯救病毒并测定其生物学特性，探讨S1和S4基因与病毒毒力的相关性；根据MDRV强、弱毒株S1和S4基因核苷酸序列的差异进行定点突变，构建MDRV强弱毒突变嵌合体重组质粒，获得拯救病毒并测定其生物学特性，明确S1和S4基因与毒力相关的分子定位。研究结果有望从分子水平揭示番鸭呼肠孤病毒的致病机理和致弱机理，丰富番鸭呼肠孤病毒的分子信息和研究内涵，为进一步开展MDRV基因及表达蛋白的功能研究提供技术平台，也为番鸭呼肠孤病毒病的有效防控和净化奠定基础。

番鸭呼肠孤病毒（MDRV） MS强毒株和CA弱毒株全基因核苷酸共计22,969bp，两个毒株显著差异在于（1）MS株L1基因1159-1161核苷酸为CAG，而CA株变异为TAG，CA株λ1蛋白在380位出现终止密码子，蛋白终止表达。（2）MDRV MS株和CA株抗原性方面主要集中在σA蛋白25-30位，σC蛋白110-120，150-160，245-250存在抗原性差异。因此推测以上差异是导致番鸭呼肠孤病毒致弱的可能原因。.1、番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统构建 根据MDRV基因片段设计引物，并添加SapI酶切位点和保护性碱基。利用PCR技术和酶切剪切拼接技术获得MDRV MS株和CA株10个基因全序列。通过SapI酶切和DNA连接酶将基因片段分别于pBD-initial载体连接，构建转染质粒，并转化大肠杆菌JM109。提取质粒,利用Lipofectamine2000转染试剂将MDRV MS株或CA株10个感染性克隆质粒以1:1的比例混合共转染单层293T细胞，进行病毒拯救。MDRV-rMS和MDRV-rCA重组病毒传代至15代细胞病变稳定，获重组拯救病毒。.2、番鸭呼肠孤病毒毒力相关基因确定 以MDRV MS基因为骨架分别替换MDRV CA株L1基因、S1基因和S4基因，获得拯救病毒。通过动物感染实验证实以MDRV-MS株为基因骨架分别替换MDRV-CA株S1和S4基因所拯救的病毒不会引起病毒对番鸭感染能力的改变，而以MDRV-MS株为基因骨架替换MDRV-CA株L1基因所拯救的病毒对番鸭的感染能力大大降低。因此推测导致番鸭呼肠孤病毒毒力减弱的分子位点在于L1基因。.3、番鸭呼肠孤病毒毒力减弱分子位点确定 通过PCR技术定点突变，将MDRV MS株和CA株L1基因进行改造，MDRV-MS株L1基因1159 C和 CA株L1基因1159T进行互相替换。以MDRV MS株（CA株）基因为骨架，替换改造的 CA株（MS）株L1基因，来拯救病毒。通过动物感染实验证实了以MDRV-MS株L1基因1159 C改造成CA株L1基因1159T时，导致毒力下降明显。 而以MDRV-CA株L1基因1159 T改造成MS株L1基因1159C时，导致毒力上升明显。.因此番鸭呼肠孤病毒毒力减弱的分子位点为L1基因1159位的变异。1159C为强毒株特征，1159T为弱毒株特征。