不同小肽调控大菱鲆蛋白质利用的差异及作用机制

The small peptide, most end product of protein digestion in the digestive tract, play a very important part in protein nutrition. However, so far it has not been known the peptide what is the complete process in fishbody and how to affect fish metabolism. In this project, Scophthalmus maximus L. is chosen as research species to study the effect of different dietary peptides on difference and metabolism of amino acid digestibility, absorption, transport, PepT1, LAT2, B0AT1mRNA expression, TOR and UPP signal transduction pathway in order to clarify the differences in the digestion, absorption, transport, metabolite of amino acid and protein synthesis, proteolysis. In addition, metabolites of turbot will be studied based on NMR spectroscopy combined with pattern recognition techniques to understand peptide metabolic pattern and the main differences of peptide metabolism. We will focus on the effect of dietary peptides on the expression spectroscopy of key changes in physiology and biochemistry and protein expression in key organs. The main methods used in present project will be metabolomic, differential proteomic, bioinformatics. As the aim of this project, we hope to realize regulative rule of amino acid absorption, transport, metabolism and protein synthesis, proteolysis in turbot and furthermore, clarify the mechanism of the effects of dietary peptides on the complete process and adjusting system in turbot. As a result, it will lay a theoretic foundation not only for the reasonable utilization of protein source but also supply for methodological base to develop the study of fish nutrition systemically and higher efficiently.

蛋白质在消化道中的消化终产物通常含有一定量小肽，它能完整地被吸收并以二、三肽形式进入血液循环，在蛋白质营养中有着重要的作用。迄今为止，小肽在鱼体内完整营养过程及代谢机制还不清楚，本项目拟采用代谢组学、差异蛋白组学、生物信息学等现代技术，以大菱鲆为动物模型，系统研究不同小肽对大菱鲆机体氨基酸消化、吸收、转运、代谢能力的差异及机制；通过蛋白质合成重要信号通路TOR及蛋白质降解重要通路UPP中关键基因的克隆、mRNA定量表达及蛋白质表达的研究；结合不同小肽对大菱鲆组织中代谢物组及蛋白质组差异分析；分别从不同层面、不同角度揭示不同小肽对鱼体内氨基酸的消化、吸收、转运、代谢和蛋白质合成分解的差异，明晰小肽在鱼体内完整营养过程及代谢调控体系，系统地分析其作用机制。研究结果对于最大限度提高蛋白质在鱼体的沉积，充分利用蛋白质资源，提供重要科学依据和研究思路，具有重要的科学意义和应用价值。

鱼类利用小肽的营养生理过程，包括摄食、消化、吸收、转运、信号应答及代谢机制，至今尚无人知晓。对于水解鱼蛋白的研究仅限于不同水平及不同分子量分布的水解鱼蛋白对鱼类消化、吸收、代谢的研究，究竟是哪一种小肽起主导作用？不同小肽对鱼类氨基酸的吸收和代谢有何差异？关键差异点主要存在于哪些路径？成为一个令人感兴趣的问题。.本项目的执行期为2017年1月-2020年12月，围绕大菱鲆对不同小肽的利用差异开展一系列的研究。研究结果阐明大菱鲆对以二肽形式赖氨酸和亮氨酸（Lys-Leu）相比三肽（Lys-Leu-Lys/Leu-Lys-Leu）和晶体氨基酸形式的利用效率更高，其主要原因在于二肽形式提高了大菱鲆的胃蛋白酶、肠道胰蛋白酶等与蛋白质消化相关酶活性，调节小肽转运载体PepT1和氨基酸转运载体B0AT1和y+LAT2的表达促进对相应必需氨基酸的吸收，通过调控肌肉蛋白质合成（Atk/TOR）和分解（Atk/FoxO）相关通路促进肌肉蛋白质沉积。在此基础上，进一步比较大菱鲆对不同二肽的利用，阐明尽管不同二肽对大菱鲆幼鱼鱼体营养组成、肌肉氨基酸组成和肌纤维形态结构均无显著影响，但Lys-Leu形式二肽能更有效调节前肠氨基酸转运载体（B0AT1、CAT1、PAT1和y+LAT2）表达，提高大菱鲆对饲料的利用效率。在明确Lys-Leu二肽作用后，利用代谢组学技术，阐明在代谢层面，Lys-Leu二肽会影响肝脏赖氨酸的合成与分解，支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的合成与分解、色氨酸代谢、花生四烯酸代谢、氨基酸转运等多个代谢过程。利用蛋白质组学技术阐明二肽形式的Lys-Leu从蛋白质代谢通路方面主要影响赖氨酸分解代谢、调控蛋白质合成的mTOR信号通路及其上游的PI3K-ATK信号通路。对于最大限度提高蛋白质在鱼体的沉积，充分利用蛋白质资源，提供重要科学依据和研究思路，具有重要的科学意义和应用价值。.主要成果包括（1）阐明了小肽与小肽转运、氨基酸转运的调控关系；（2）阐明了不同小肽在大菱鲆体内消化和吸收差异及机制；（3）阐明不同小肽对大菱鲆蛋白质合成和分解重要信号通路的调控关系；（4）揭示了不同小肽在大菱鲆鱼体蛋白及代谢标志物差异及规律。