ALA光动力诱导HPV16E7转染角质形成细胞凋亡机制研究

人乳头瘤病毒（HPV）感染率逐年增高和致癌性严重危害人类健康。本项目组在国际上率先报道采用现代新技术5-氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）治疗尿道尖锐湿疣临床与基础研究，初步证明其满意的临床疗效是通过ALA-PDT所产生的细胞坏死和细胞凋亡两种方式实现，但最具治疗意义的凋亡途径至今未被揭示。我们推测线粒体途径有可能是介导ALA-PDT产生细胞凋亡的主要途径。为此，采用HPV16E7基因转染到人永生化角质形成细胞HaCaT细胞内，以HaCaT/E7细胞系作为研究模型，通过检测ALA-PDT在不同时间点HaCaT/E7的PpIX荧光强度，确定最佳ALA孵育时间，探索ALA-PDT诱导产生HPV感染细胞系发生凋亡的信号途径和不同光照剂量对其作用机制的影响，为临床更广泛地应用ALA-PDT新技术和研发新的靶向性治疗提供理论依据。

研究目的：.1、构建HPV16E7基因转染角质形成细胞系，将该细胞系作为观察ALA-PDT对HPV感染角质形成细胞凋亡途径影响的研究模型。.2、探讨HPV感染角质形成细胞的最佳ALA孵育时间和ALA光动力诊断（photodynamic diagnosis, PDD）诊断HPV感染性疾病的实验数据。.3、研究ALA-PDT对HPV感染角质形成细胞杀伤的作用机制，明确ALA-PDT诱导HPV感染角质形成细胞的凋亡通路，进一步将ALA-PDT推广应用于治疗HPV携带者和亚临床感染与潜伏感染的患者。.研究结论：.1.成功构建了HPV16E7转染角质形成细胞的模型，为目前尚缺乏HPV感染动物模型情况下，提供新的研究思路和寻求新的研究技术。.2.通过对细胞原卟啉IX的研究，从细胞学水平上辅助证明了临床上用于光动力治疗HPV感染性疾病的的最佳封包时间为3-5小时，而用于光动力诊断时间可为1小时 。.3.ALA光动力诱导HPV感染细胞以坏死和凋亡两种方式引起死亡，小剂量的光动力主要以凋亡为主，而大剂量的光动力以坏死为主，呈一定的时间依赖性 。.4.ALA介导的PDT诱导的细胞凋亡可改变线粒体膜电位，膜电位的改变早于细胞形态和磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面，提示凋亡与线粒体的结构和功能有关。.5.ALA- PDT可上调 HaCaT/HPV16E7细胞中 Caspase-9、Caspase-3活化片段蛋白表达量，证明其诱导HPV感染角质形成细胞的凋亡途径主要通过线粒体途径 。.6.ALA-PDT对HaCaT/HPV16E7细胞内Caspase-3、Caspase-9的基因表达量无明显影响，显示其介导的线粒体凋亡途径发挥可能未通过基因水平而仅在蛋白质水平。