DAMPs介导ALA光动力作用增强皮肤鳞状细胞癌激发抗肿瘤免疫反应的机制研究

Squamous cell carcinoma (SCC) was treated by ALA-photodynamic therapy (ALA-PDT) and achieved satisfied outcomes. Our group has discovered other underlying machenism of PDT treatment and we hypothesized that damage associated molecular pattern (DAMPs) are very important for stimulating the tumor immunity of SCC by ALA-PDT. In order to confirm the hypothesis, we have established the SCC model of SKH-1 hairless mouse. At the basis of our previous studies, we will confirm ALA-PDT can enhance the immunogenicity of SCC model. We will analyze the regulatory role of ALA-PDT on dendritic cell TLR-4 by mediating the secretion of DAMPs from SCC. And we also will study the molecular mechanism of how ALA-PDT enhances SCC cell immunogenicity via DAMPs and TLR/RAGE-NF-κB pathways. An insight view into the mechanism can throw lights on the new mechanism of ALA-PDT treatment of SCC, and provide new theoretical evidence on the clinical effect and reducing the recurrence.

ALA-PDT治疗皮肤鳞状细胞癌（SCC）已取得满意疗效，本课题组研究发现PDT的治疗作用还存在免疫学机制，我们推测DAMPs很可能在介导ALA-PDT作用增强SCC激发抗肿瘤免疫过程中发挥着重要作用。为证实以上设想，本项目在已建立SKH-1无毛小鼠SCC模型及前期研究基础上，确证ALA-PDT对SKH-1无毛小鼠SCC免疫原性的增强作用；通过分析ALA-PDT作用SCC细胞释放的DAMPs对树突状细胞TLR-4的作用与影响，明确ALA-PDT经 DAMPs介导通过TLR/RAGE-NF-κB途径增强SCC细胞免疫原性的分子机制。深入认识DAMPs介导ALA光动力作用增强SCC激发抗肿瘤免疫反应的机制，将有助于深入认识ALA-PDT对肿瘤的治疗作用，为进一步提高其临床疗效、降低复发率提供新的理论基础。

背景 ALA-PDT能够诱导抗肿瘤免疫，其机制尚待探讨。.目的 探索ALA-PDT是否能够诱导皮肤鳞癌细胞表达DAMPs，从而增强皮肤鳞癌细胞免疫原性，并探讨其分子机制。.方法 在已建立SKH-1无毛小鼠SCC模型基础上，培养小鼠皮肤鳞癌细胞，确证ALA-PDT对SCC免疫原性的增强作用；研究ALA-PDT作用后SCC细胞释放的DAMPs对DCs表面TLRs的影响，分析ALA-PDT经DAMPs介导，是否通过TLR-NF-κB途径增强SCC抗肿瘤免疫反应。.结果 成功从小鼠皮肤鳞癌组织中获得皮肤鳞癌细胞，并构建种植性小鼠皮肤鳞癌模型。通过原卟啉Ⅸ的荧光动力学研究，选择0.5 mM ALA及孵育5h为ALA-PDT体外处理皮肤鳞癌细胞最适ALA参数。0.5J/cm2 ALA-PDT后鳞癌细胞以凋亡为主，2J/cm2 ALA-PDT后细胞以坏死为主。ALA-PDT后的鳞癌细胞可促进DCs形态成熟（树突增长变粗，胞内溶酶体增多）；表型成熟（DCs表面MHC-Ⅱ、CD80、CD86表达明显上调）；功能成熟（DCs分泌的INF-γ、IL-12增多，刺激T细胞增殖能力增强）。体内实验发现，ALA-PDT作用后肿瘤细胞可以预防皮肤鳞癌的发生。ALA-PDT可上调小鼠鳞癌组织和鳞癌细胞中HMGB1、CRT、HSP70的表达，促进鳞癌细胞分泌HMGB1和HSP70，诱导皮肤鳞癌细胞中CRT和HSP70发生膜转位。ALA-PDT处理后皮肤鳞癌细胞促使DCs表面的TLR2、TLR4，I-κB、pI-κB及细胞核内的NF-κB表达上调，当HSP70、HMGB1和CRT分别或同时被抑制时，PDT-DCs表面的TLR2的表达水平降低。当HSP70、HMGB1分别被抑制或HSP70、HMGB1和CRT同时被抑制时，PDT-DCs的TLR4、I-κB、pI-κB及细胞核内的NF-κB表达水平降低，但是当CRT被抑制时，PDT-DCs 的TLR4、I-κB、pI-κB及细胞核内的NF-κB表达水平未见明显改变。.结论 ALA-PDT可促进鳞癌细胞表达大量的DAMPs，增强肿瘤细胞的免疫原性，涉及主要分子机制是活化了DCs的TLRs-NF-κB信号通路。本研究揭示了ALA-PDT治疗SCC的免疫学新机制，为提高ALA-PDT治疗SCC的临床疗效、降低复发率提供新的理论。