基于TGF-β1/Smads信号转导通路研究紫朱软膏对下肢静脉性溃疡成纤维细胞的作用机制

The venous leg ulcers (VLUs) is the hotspot in study of chronic ulcer of lower limb. The Zizhu Ointment could treat VLUs with an exactly clinical curative effect according to previous clinical trials. We all know that there are various growth factors in the suppuration of VLUs, It’s well known that there suppuration in CLUs wound is rich in various growth factors, transforming growth factor TGF-β plays an important role in wound repair, TGF-β1 signal transduction pathways and the related proteins can guid the wounds’ treatment. Previous work shows that fibroblasts play a role of all the process of wound repair. Therefore, this project is trying to connect the key repair cells in wound healing (fibroblasts) with the contact pathway (TGF-β1/smads), to explore the mechanism of the Zizhu Ointment in healing CLUs，The mechanism may be related to the multidirectional regulation of fibroblast activity by the TGF- beta 1/smads signaling pathway. We will make the rabbit model of VLUs, Based on the technology of the Conventional Cytogenetic, immunohistochemistry, Western Blot and liquid mass spectrometry, we will explore the significance of the TGF-β1/smads in VLUs wound healing from the molecules, cells, tissue, and the animal level aspects according to the rabbit model of VLUs. The primary purpose is clarifying the significance of the theory of “Remove blood stasis, tonify deficiency gave birth to the new” in VLUs healing by analyzing the possible effective components.

下肢静脉性溃疡（VLUs）是目前下肢慢性溃疡中研究的热点。前期的临床研究已得知紫朱软膏治疗VLUs疗效确切。众所周知VLUs创面脓液中富含各种生长因子，其中转化生长因子TGF-β1在创面修复中具有重要作用，TGF-β1信号通路相关蛋白可用于指导创面治疗。以往工作发现成纤维细胞贯穿创面修复过程始终。因此，本课题尝试将创面愈合过程中的关键修复细胞（成纤维细胞）与联系密切通路（TGF-β1/smads）结合起来，提出“紫朱软膏促进VLUs愈合，其机制可能与TGF-β1/smads信号通路多方位调控成纤维细胞有关”的假说。我们通过大白兔VLUs模型，采用常规染色、免疫组化、WesternBlot以及液相质谱分析等技术，从分子、细胞、组织以及动物整体水平等多方面探讨TGF-β1/Samds在VLUs创面愈合中的重要作用，并分析其可能的有效成分以阐明“补虚祛瘀生肌”理论对VLUs愈合重要意义。

背景.下肢静脉性溃疡（VLUs）属于难治性溃疡范围，严重影响患者生活质量而成为临床上亟需解决的关键问题，其发病率高，愈合慢且易复发，随着年龄的增加患病率逐渐升高。.主要研究内容.本项目以成纤维细胞为创面修复的切入点，研究紫朱软膏促进VLUs愈合的分子细胞基础，并观察 TGF-β1/smads 信号通路在创面不同修复时段，不同病理背景上的动态变化，研究成纤维细胞形态功能状态及相关蛋白表达与溃疡修复过程的动态关系。.重要结果及关键数据.采用静脉高压模型+下肢慢性溃疡模型建立VLUs的大白兔模型。.分为七组：紫朱软膏a组，生长因子b组，静脉性溃疡疮面c组，正常溃疡d组，基质组e组，VLUS+SB431542+紫朱软膏f组，VLUS+SB431542 g组.1)肉眼观察疮面各期时间：炎症期（0-7天）、增殖期（7-14天）及重塑期（14-21天）；.2)电镜下观察疮面：第7天，a 组可见大片鲜红色肉芽组织；第14天b、f组可见大片鲜红色肉芽组织形成；第21天，a组完全愈合；b、f组基本愈合；c、e组部分假性愈合。d、g组面积减少。.3)HE 染色图片（×400）组间观察:a组成细胞结构排列整齐，成纤维细胞增多明显，VLUs组细胞结构排列紊乱，成纤维细胞增多不明显； .4)用Western blot法检测VLUs兔子TGF-β1/Smads信号转导通路关键蛋白水平，紫朱软膏外用于VLUs能上调 p-Smad 3、p-Smad 2、α-SMA、PCNA、TGF-β1、Collagen III、Collagen I蛋白的表达，能下调 Caspase3、Smad 7蛋白的表达 ( P ＜ 0. 05)。.5)免疫组化 SP 法检测VLUs兔子TGF- β1/Smads信号转导通路调关键蛋白水平，紫朱软膏外用于VLUs能上调 p-Smad3、p-Smad 2、α-SMA、PCNA 、TGF- β1 、collagen III、Collagen I 蛋白的表达，能下调 Caspase3、Smad7蛋白的表达 ( P ＜0. 05) 。.6)紫朱软膏中可能有效成分分析：利用液相质谱技术，建立了油脂性紫朱软膏中紫草、龙血竭、冰片的含量测定方法。.科学意义.从分子、组织以及动物整体水平等多方面探讨TGF-β1/Samds在紫朱软膏外用于VLUs创面愈合中的重要作用。