肥大型软骨细胞多分化命运的调控机制

The finding of the multi-potential of hypertrophic chondrocyte has completely changed the traditional concept about the fate of hypertrophic chondrocyte. Our previous studies have revealed that hypertrophic chondrocytes adopt various mesenchymal fates including osteogenic fate in bone marrow, using in vivo clonal analysis based on lineage tracing strategy. This project aims to elucidate the cellular and molecular mechanisms underlying the multiple fates of hypertrophic chondrocytes. Using mouse as the model organism, combining in vivo lineage tracing, real-time fluorescence imaging, conditional gene knockout and omics technologies, the differentiation process and the terminal fate of hypertrophic chondrocytes will be observed to determine whether hypertrophic chondrocytes directly become mesenchymal cells like osteoblasts or multiple potential progenitor cells. The functions and related mechanisms of important signaling pathways and genes controlling autophagy in the regulation of the multiple fate of hypertrophic chondrocytes will be investigated by analyzing the gene knockout mice. We would expect to provide new mechanistic insights into the skeletal development and homeostasis as well as related bone diseases.

肥大型软骨细胞多分化潜能的发现颠覆了人们对其命运的传统认识。我们此前的研究首次利用体内细胞谱系克隆分析实验发现肥大型软骨细胞可以转变为包括成骨细胞在内的多种骨髓间质细胞，证明肥大软骨细胞具有多潜能性。本申请将基于我们长期工作的基础，解析肥大型软骨细胞多分化命运的细胞和分子机制。以小鼠为模式动物，综合利用体内细胞谱系示踪技术、实时荧光成像技术、条件基因敲除技术、组学技术，对肥大型软骨细胞的分化过程和终极命运进行实时观测，探索肥大型软骨细胞是否直接转变为成骨细胞等间质细胞抑或是转变为具有多向分化潜能的前体细胞。通过对骨骼发育相关重要信号通路受体或转录因子的软骨细胞特异性基因敲除小鼠进行表型筛选和分析，探索重要信号通路以及细胞自噬关键基因在肥大型软骨细胞转分化中的作用及机制，期望能解析肥大型软骨细胞多分化命运的调控机制，为全面理解骨骼发育和稳态维持以及相关骨骼疾病发生机制提供新的理论基础。

本项目利用细胞谱系示踪技术、单细胞多组学技术和条件基因敲除技术研究了肥大型软骨细胞多分化命运的细胞和分子机制。我们建立了2种全新的软骨细胞及其子代细胞的体内遗传谱系示踪工具小鼠，完成了多套肥大型软骨细胞及其子代细胞的单细胞转录组测序（scRNA-seq），以及结合单细胞核RNA测序（snRNA-seq）和单细胞核染色质可及性测序（snATAC-seq）的单细胞多组学测序；从11种肥大型软骨细胞条件基因敲除小鼠中筛选到9种影响肥大型软骨细胞分化命运的突变小鼠；利用细胞谱系示踪技术结合单细胞测序数据，筛选到多种影响肥大型软骨细胞重编程和多分化命运的基因；研制了Hgs、PTEN/Akt、Prmt5、Smad4等条件基因敲除小鼠，完成了这些基因突变小鼠的表型分析工作；利用全新的基于Dre-Rox/Cre-LoxP双重组酶的序列性细胞谱系示踪技术，完成了对肥大型软骨细胞去分化/转分化的记录和分析。我们提供了直接的体内实验证据证实了肥大型软骨细胞具有重编程并去分化为骨骼干细胞和转分化为成骨细胞的双重命运，发现了一群具有自我更新和多分化潜能的新型骨骼干细胞——干骺端骨骼干细胞（mpSSC）及其参与骨小梁形成和骨再生的功能，揭示了Hgs、PTEN/Akt、BMP/Smad4等多种信号通路功能基因，以及Prmt5等表观遗传调控分子决定肥大型软骨细胞多分化命运的功能和机制。这些研究结果揭示了肥大型软骨细胞多分化命运调控的新机制，建立了一种新的骨小梁形成的细胞范式，为全面理解骨骼发育和稳态维持以及相关骨骼疾病发生机制提供了新的理论基础。