钠钾泵在磷酸钙陶瓷骨诱导过程中的作用及其机制研究

The Osteoinductivity of calcium phosphate ceramics has been widely accepted and applied in clinical bone defects treatment. However, the cellular and molecular mechanism of how calcium phosphate ceramics contribute to osteoinduction is still unclear. Literature studies and our preliminary experiments show that the expression and activity of sodium-potassium pump (NKA) closely corresponds to osteogenicity and osteoinductivity. In this project, we focus on the primary cellular event related to the degradation and absorption of the calcium phosphate material. According to the function of NKA and scientific evidences, we proposed a transmembrane calcium and phosphate ion transport model which is mediated by NKA. Based on this model, we aim to study the function and mechanism of NKA involved in the osteoinduction process of calcium phosphate ceramics. By using calcium phosphate ceramics of various degradation rate and osteoinductivity, the material factors correlated with the function and activation of NKA mediated ion transport will be explored. Furthermore, stimulation of NKA activity via different methods will be combined with advanced biological, imageologic and nano-mechanical tests to study its effect on mesenchymal stem cells proliferation, adhesion and osteogenic differentiation in vivo and in vitro. Through this project, we hope to provide useful experimental and theoretical foundation to further unveil the cellular and molecular mechanism underlying the osteoinductivity of biomaterials.

磷酸钙基陶瓷材料的骨诱导能力已被广泛接受并实际应用于临床骨修复，但其骨诱导能力的细胞和分子生物学水平机理尚未明确。大量文献和前期研究结果表明，钠钾泵的表达量和活性与机体的成骨能力和骨诱导途径密切相关。本项目着眼于材料降解及吸收这一初始细胞事件，拟以耗能钠钾泵为切入点，基于科学事实提出一种全新的钠钾泵介导的钙、磷离子跨膜转运模型。并以此为基础，以研究钠钾泵在骨诱导过程中的作用和机制为目的，通过制备不同降解速率和骨诱导性的磷酸钙材料，初步探索激活钠钾泵离子转运功能的材料学因素；采用多种生化手段调节钠钾泵的活性，结合先进的细胞分子生物学技术、影像学及纳米压痕力学测定技术，从体内外实验角度考察钠钾泵的离子转运功能与间充质干细胞的增殖、黏附、成骨分化以及材料异位成骨能力之间的联系和作用机制。为进一步从细胞和分子水平去深入认识和揭示生物材料骨诱导机制提供实验和理论基础。

多孔磷酸钙陶瓷的骨诱导性已经被广泛证实，然而其骨诱导机理至今尚未阐明。本项目基于基因芯片结果中关于钠钾泵及其调控因素的差异表达，重点考察了钠钾泵（NKA）这一特殊膜功能蛋白是否在磷酸钙骨诱导过程中具有介导作用。项目组首先以体外干扰钠钾泵的基因表达和抑制/激活其蛋白活性来考察这些变化对BCP陶瓷促MSCs成骨分化的影响；其次，在BCP陶瓷植入小鼠肌肉后，有效调节小鼠体内钠钾泵活性，考察了钠钾泵的活性对BCP陶瓷诱导骨生成的影响。.体外BCP陶瓷与MSCs共培养体系实验中，项目组检测到BCP陶瓷在与MSCs接触后6小时内 MSCs中成骨基因、钠钾泵、钠钙泵的表达的显著上调。随后，以NKA的活性抑制剂（ouabain）和激活剂（DR-Ab）来调控MSCs中NKA的活性。通过western blot实验，本研究发现：① DR-Ab在有效提高细胞膜上功能性NKA比例的同时，还增加了MSCs的骨钙素（OCN）分泌；② 本文首次检测到，BCP陶瓷材料本身具备增强NKA活性的作用；③ 蛋白磷酸酶2 （PP2A）在DR-Ab激活NKA，以及之后的促成骨分化作用中必不可少。体内研究中，为考察干扰NKA活性对BCP陶瓷诱导骨生成的影响，在小鼠肌肉内植入BCP陶瓷后，采取定期系统性注射NKA活性干扰剂。植入后5个月，H&E染色观察显示，各组样品中BCP+DR-Ab组新骨生成面积最多。项目组还对体内实验的样品在植入前后进行了Micro-CT扫描，结果显示植入5个月后，BCP+DR-Ab组材料表面结构崩解最多，孔径变大，孔隙率增大，但孔壁增厚，密度变大。说明这组材料本身降解较多，但其新生骨也较多，骨沿孔壁延伸，增加了孔壁厚度，从而弥补了材料的降解，从整体增加了密度。体内实验多种检测手段一致显示，激活钠钾泵有利于磷酸钙陶瓷的骨诱导发生。.综上所述，本项目针对钠钾泵的体内外研究首次发现，骨诱导性磷酸钙可提高MSCs中钠钾泵的基因表达和活性，改变钠钾泵在细胞内和膜上的聚集和分布。通过特异性抗体作用增强钠钾泵的活性，结果有利于细胞成骨分化及体内材料非骨部位植入后骨诱导的发生。钠钾泵的表达及其活性、细胞分布在磷酸钙骨诱导过程中具有重要作用。