HPV6b编码的miRNA促进HPV感染细胞免疫逃逸的分子机制

研究证实病毒编码的miRNA在病毒感染宿主过程中对病毒复制和宿主细胞防御功能起着重要作用，寻找miRNA及其靶基因的研究正成为基因调控领域的重要分支和热点。本研究在我们前期预测及定制高通量miRNA芯片筛选的基础上，将利用miRNA在线软件推测和计算HPV6b编码的miRNA所调控的靶基因，并确定出目标HPV6b-miRNA；进一步合成miRNA和miRNA inhibitor，揭示目标HPV6b-miRNA对免疫逃逸相关信号通路中靶基因的调控作用。试图从全新视角阐明特异性HPV病毒编码的miRNA是HPV免疫逃逸、尖锐湿疣（CA）反复发作的新的分子机制，探索今后开发miRNA药物治疗CA的可能性和可行性，为发现能阻断CA反复发生的新靶点提供实验依据，完善和丰富性病领域的治疗方法，拓展病毒感染基因治疗的新思路。

1. CA样本中miRNA的差异表达.（1）miRNA芯片筛选出表达上调或下调4倍以上且阳性信号反应值>500的13个miRNA作为差异表达miRNA，其中以miR-31表达增高最为显著。.（2） 荧光定量PCR扩大验证证实除了miR-195和miR-30b表达无明显差异外，其余miRNA均有差异表达，其中miR-31表达增高最为显著。miR-31的表达与发作次数和病程密切相关，且与病程呈正相关。.（3）构建出CA差异表达miRNA-基因调控网络图。.2. miR-31对HPV感染细胞及角质形成细胞增殖、凋亡以及细胞因子表达的影响，及其调控靶基因的筛选和验证.（1）成功构建了表达pre-miR-31模拟物和miR-31抑制物的重组慢病毒。建立了稳定感染并表达pre-miR-31模拟物和抑制物的HeLa细胞、SiHa细胞和HaCaT细胞。.（2）MTT结果显示稳定表达miR-31模拟物和抑制物的HeLa细胞、SiHa细胞组间细胞增殖和活力无显著差异，时序性miR-31差异表达组间细胞增殖无明显差异。Annexcin-V-PE凋亡检测结果显示稳定表达miR-31模拟物和抑制物的HeLa细胞和SiHa细胞组间凋亡细胞比例无显著差异。.（3）ELISA结果显示，在poly（I:C）的协同刺激下，miR-31抑制物能够促进HeLa和SiHa细胞分泌炎症细胞因子IL-1β和IL-6、趋化因子IL-8、CXCL-1和RANTES以及I型干扰素IFN-α和IFN-β；能够促进HaCaT细胞分泌炎症细胞因子IL-1β和IL-6、趋化因子IL-8、CXCL-1和RANTES以及I型干扰素IFN-β和II型干扰素IFN-γ。.（4）根据差异表达miR-31的HeLa细胞组间基因差异表达谱的结果，结合软件预测结果筛选出miR-31可能调控的下游靶基因——MAP3K1、MAP3K14、MAP4K5、HLA-A、IRF1和PKC等，差异基因位于MAPK/NFκB信号通路上。荧光定量PCR检测及westernblot实验证实差异表达miR-31组间MAP3K1的表达有显著差异。.（5）成功构建出MAP3K1 3’UTR野生型和突变型载体。荧光素酶报告实验显示miR-31模拟物对野生型载体中的报告荧光有明显的下调作用；对其预测靶位点进行突变后，突变型载体中的报告荧光有所恢复。